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1、血小板血型系统及检测技术,1,教学内容,血小板血型抗原及其抗体 血小板血型检测技术 血小板血型的临床应用 适合型血小板输注,2,教学目的,重点掌握：血小板输注无效 掌握：血小板血型检测技术 熟悉：血小板血型抗原及其抗体 血小板血型的临床应用 了解：适合型血小板输注,3,一、血小板血型抗原 及其抗体,4,（一）血小板血型抗原,定义: 指用同种免疫抗体检测出 的血小板表面抗原分类：血小板相关抗原血小板特异性抗原,5,1. 血小板相关抗原 (platelet-associated antigen),定义：血小板表面存在的与其他细胞或组织共有的抗原分类：红细胞血型系统相关抗原(ABO等）组织相容性抗原
2、（HLA）,6,血小板上的红细胞血型抗原,存在ABO、Lewis、I和P抗原缺失Rh、Duffy、Kell、Kidd和Lutheran系统的抗原,7,血小板HLA系统血型抗原,Chromosome 6,DP,DQ,DR,B,C,A,Class II,Class I,存在HLA-A和B位点的抗原HLA-C位点的抗原未发现HLA-DP、DQ和DR等位点抗原。但经细胞因子刺激，可产生HLA-DR抗原,8,2. 血小板特异性抗原,即人类血小板抗原（human platelet antigen，HPA） 血小板特有的，其他组织细胞没有 表现血小板独特的遗传多态性 均存在于血小板膜糖蛋白（GP）上,9,1
3、0,HPA的命名,1990年国际血液学标准化委员会(ICSH)/国际输血协会（ISBT）血小板血清学研讨会对血小板抗原系统进行国际命名 2003年国际输血协会（ISBT）和国际血栓和止血协会（ISTH）建立的血小板命名委员会（PNC）,11,命名规定,在系统前冠以HPA 按发现顺序用数字编号 只有在2个对偶抗原全被检测出来后，才能被称为系统，对偶抗原按其在人群中频率由高到低，用字母命名，高的为a，低的为b 尚未发现对偶抗原的，给予暂时命名，在等位基因数字后加后缀w表示,12,13,（二）血小板抗体,产生机理：机体对血小板表面或相关抗原免疫 临床分类：血循环里的游离抗体结合于血小板上的抗体(PA
4、IgG) 血型学分类：血小板同种抗体自身抗体 见于：血小板输注治疗无效同种免疫血小板减少症自身免疫血小板减少症药物、病毒、细菌引起的血小板减少症,14,血小板表面存在众多复杂抗原，因此反复大量输注血小板的患者约50%以上产生血小板同种抗体据报道HLA抗体占多数，约80%左右 HPA抗体单独存在的频率较低（2%-3%） HPA抗体与HLA抗体共存（18%）左右必须首先识别并去除血清中存在的HLA抗体，才能分析血小板抗体的特异性,（二）血小板抗体,15,鉴别有无HLA抗体存在的方法淋巴细胞毒试验混合淋巴细胞培养除去血小板表面HLA抗原方法氯喹或酸溶液在0处理血小板,16,二、血小板血型检测技术,血
5、清学检测 分子生物学检测,17,（一）血清学技术,血小板免疫荧光试验简易致敏红细胞血小板血清学试验单克隆抗体特异的血小板抗原固定试验改进的抗原捕获酶联免疫吸附试验流式细胞仪检测技术微柱凝胶血小板定型试验当HLA类抗原在血小板定型时出现强表达时，要用氯喹或酸进行预处理，去除血小板上的HLA抗原,18,1. 血小板免疫荧光试验 (platelet immunofluorescence test, PIFT),19,原理,用多聚甲醛（PFA）或氯喹预处理的血小板，加入异硫氰酸荧光标记的抗血小板抗体，通过流式细胞仪或荧光显微镜检测血小板抗原抗体结合情况,20,21,临床应用,同种异体抗体与血小板的反应
6、活性检测 血小板配型,22,方法学评价,优点 荧光信号只评估血小板，避免了由细胞碎片引起的非特异性反应 多特异性的抗球蛋白试剂可以识别IgG、IgA和IgM抗体 最可靠的方法之一缺点 对反应不敏感。血小板至少要结合1 000个IgG分子才能得到阳性结果,23,2. 简易致敏红细胞血小板血清学试验 （Simplified Sensitized Erythrocyte Platelet Serology Assay, SSEPA）,24,原理,将血小板抗原固定在U型孔壁上，与被检血清反应后洗净，以抗IgG（或抗IgM)指示细胞反应结果 如果血小板上结合了血小板抗体，则致敏在指示细胞上的抗IgG（抗
7、IgM）与血小板抗体结合，指示细胞向孔底移动被组织，广泛覆盖在固定的血小板单层上，为阳性结果 若血小板上无抗体，则指示细胞向孔底移动不受阻，聚集在孔底中央，呈扣状，为阴性结果,25,阳性结果,阴性结果,26,结果图示,27,方法,直接测定法：测定血小板表面结合的血小板抗体间接测定法：测定血清内的血小板抗体交叉配血试验：选择配合的血小板供体,28,临床应用,血小板抗体鉴定血小板血型研究开展母婴血小板血型及多种血液病的研究适合性血小板输注,29,方法学评价,简单、微量，重复性、特异性和敏感性均较理想应用范围广，可用于检测血小板抗原抗体以及交叉配合试验；可开展大量样本的检测工作及研究工作固相化的血小
8、板及指示细胞能长期保存备用不需要特殊的仪器设备，易于推广,30,3. 单克隆抗体特异的血小板抗原固定试验 (Monoclonal antibody-specific immobilization of platelet antigens assay, MAIPA),31,原理,在血小板上先结合人的同种抗体，然后再结合鼠抗人血小板抗体，裂解血小板后，把裂解产物移至包被的羊抗鼠IgG微孔板内，通过辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG检测人的血小板同种抗体,32,单克隆抗体特异的血小板抗原固定试验,33,方法学评价,优点：敏感性强。可检测出被污染的抗体、微量抗原（HPA-5）、低频率抗原。缺点：在未知抗原
9、检测时必须使用一组单克隆抗体，而又不能对所有糖蛋白具有活性如果人抗体与单克隆抗体和同一个抗原决定簇反应，就会引起假阴性结果,34,4. 改进的抗原捕获酶联免疫吸附试验 (Modified antigen capture ELISA, MACE),35,原理,血小板与抗体致敏，将形成的抗原-抗体复合物分别加入包被有抗GP Ib、GP IIb、GP IIIa、GP IX、HLA等鼠抗人单克隆抗体的微孔内，再加入酶标羊抗人IgG 底物显色，终止反应后测405nm吸光度,36,方法学评价及应用,优点：特异性较高缺点：非特异的物质和某些血清中的IgG结合非常牢固应用：对于已经去除了HPA-1a的大量标本
10、的定型常使用竞争性ELISA技术,37,5. 流式细胞仪检测技术 (Flow cytometry, FCM),38,原理,免疫荧光标记技术，抗原抗体结合 同一激光光源激发得到特异荧光色 细胞体积、结构、荧光种类及性质等多种参数分析,39,FCM检测血小板相关抗体,40,6. 微柱凝胶血小板定型试验 （microcolume gel test for platelet typing）,41,原理,向微柱凝胶中依次加入待检血清、血小板、指示红细胞阳性结果：若待检血清中存在血小板抗体，则形成血小板-血小板抗体-抗IgG-指示红细胞四位一体的免疫复合物不能通过凝胶柱阴性结果：若待检血清无血小板抗体，则
11、不能形成免疫复合物，指示红细胞离心后沉于柱底,42,43,44,45,46,47,方法学评价,方法快速、敏感、操作简单 操作标准化（试剂、设备、工作程序） 标本试剂用量少 结果判断客观准确 结果保存时间长（数天或数周） 安全：减少医源性传播,48,（二）分子生物学检测,22个HPA抗原中除HPA-14bw基因外，其它所有HPA基因多态性都表现为SNP（单核苷酸多态性），因此检测SNP的方法基本上适用于HPA基因分型 共同特点：以聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）为基础，所不同的只是在于PCR引物设计以及检测PCR产物的方法,49,方法,PCR-SSP:
12、首选，最简单常用，快速经济 PCR-RFLP: 繁琐，无法对HPA-4基因分型 PCR-ASO: 繁琐，不太容易判断结果 SSCP： 不适合常规HPA检查 DNA序列分析法: 操作复杂，成本较高,50,51,（三）血清学检测与分子生物学检测的关系,血清学检测 简单、快速 成本低 主要用于血小板抗体检测和交叉试验 血型抗原的血清学定型是基因分型的前提,52,三、血清学检测与分子生物学检测的关系,分子生物学检测 结果准确、可靠 不需要特异性抗体的血小板 基因组DNA的来源：可为尿沉淀物、口腔黏膜细胞和羊水细胞 主要用于血小板血型抗原分型,53,三、血小板血型的临床应用,血小板输注无效输血后紫癜新生
13、儿同种免疫性血小板减少性紫癜特发性血小板减少性紫癜,54,（一）血小板输注无效 (platelet transfusion refractoriness, PTR),55,1. 定义,指患者在输注合适剂量的血小板后没有产生“适当的反应”，即连续两次输注足量随机供者血小板后，没有达到合适的校正血小板计数增加值（CCI），临床出血表现亦未见改善 长期依靠血小板支持治疗 这是临床输血中颇为棘手的问题,56,2. 原因,免疫因素（17.5%） ： HLA抗体、HPA抗体、ABO抗体、自身抗体、药物抗体、循环免疫复合物等非免疫因素（67.5%） ：发热、败血症、脾肿大、骨髓移植、DIC、静注抗菌素等；血
14、小板质量非免疫+免疫因素（15%）,57,3. 判定指标,临床: 出血趋势不减轻，或出现输血性紫癜，出血加重血小板计数较输注前不仅不增高，有时还会下降 校正血小板计数增加值 (corrected count increment, CCI)CCI = (输注后血小板计数- 输注前血小板计数) 体表面积(m2) 输入血小板总数（1011L）PTR判定标准: 1 小时 CCI 7.5 109L20-24小时 CCI 4.5 109L 血小板回收率 (percentage platelet recovery, PPR)PPR = (输注后血小板数输注前血小板数)血容量(L)输入血小板总数2/3PTR判
15、定标准： 1小时 PPR30% 20-24小时PPR 20%,58,4. 预防措施,选用单一供者血小板（机釆血小板）自身血小板输注去除血小板中白细胞：WBC 5 106/L去除血小板表面抗原：用氯喹或枸橼酸解离技术去除HLA抗原紫外线照射灭活抗原提呈细胞（antigen presenting cell, APC）功能,59,5. 处理流程,首先要考虑血小板质量问题，可输注ABO 同型的非库存血小板，以排除ABO系统的抗体或血小板质量因素 若有发热、感染、DIC 等导致血小板消耗增加的因素存在，积极治疗原发病，并增加输注剂量若有同种抗体存在，则挑选HLA、HPA 相合的供者血小板，或使用激素、免
16、疫抑制剂或静脉注射免疫球蛋白 若病人持续输注血小板效果不佳而又找不到明确的原因，则应考虑药物性抗体的存在，停用或换用相关药物,60,6. 处理,供者选择：ABO和Rh相合HLA相合HPA相合 大量静脉注射免疫球蛋白（IVIG） 血浆置换 免疫抑制剂 抗纤溶药物等,61,PTR的病因及处理,62,（二）输血后紫癜 (post-transfusion purpura, PTP),63,1. 定义及临床表现,定义 指输注全血或血小板后引起的急性、暂时性的同种免疫性血小板减少综合征临床表现 在输血后1周左右突然发生 皮肤瘀点、瘀斑和黏膜出血，严重者有内脏和颅内出血 大多数的患者是女性，有输血或妊娠史,64,2. 病因,出现血小板特异性同种抗体 常见的是抗HPA-1a 通常发生于HPA-1a阴性患者，欧美多见,65,3. 预防和治疗措施,血小板抗体筛选 血小板交叉配血试验，选择配合型的血小板供体输注 免疫抑制剂 血浆置换 大量静脉注射免疫球蛋白,
