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1、第十四章,DNA的生物合成,复制(replication) 是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。,第一节 DNA复制 一、DNA的半保留复制,第一节 DNA复制 一、DNA的半保留复制,第一节 DNA复制 一、DNA的半保留复制,第一节 DNA复制,复制的方式 半保留复制(semi-conservative replication) 双向复制(bidirectional replication) 半不连续复制(semi-discontinuous replication),一、半保留复制,DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基
2、配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,半保留复制的概念:,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,C C A C T G G,G G T G A C C,A G G T A C T G,T C C A T G A C,T C C A T G A C,A G G T A C T G,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G
3、 G T G A C C,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,子链继承母链遗传信息的几种可能方式:,全保留式 半保留式 混合式,密度梯度实验:,实验结果支持半保留复制的设想。,含重氮-DNA的细菌,第一代,第二代,梯度离心结果,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义:,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个
4、方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。,二、DNA复制的方式,A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉 C. 复制接近终止点(termination, ter),真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon) 。复制子是独立完成复制的功能单位。,领头链 (leading strand),随从链 (lagging strand),三、DNA半不连续复制,顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链(leading strand) 。 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着
5、解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链(lagging strand) 。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,四、参与DNA复制的蛋白质因子,底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP； 聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶，简写为 DNA-pol； 模板(template): 解开成单链的DNA母链； 引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合； 其他的酶和蛋白质因子。,1、DNA聚合酶催化核苷酸之间聚合,全称：依赖DN
6、A的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 简称：DNA-pol,活性：,1. 53 的聚合活性 2. 核酸外切酶活性,3 5外切酶活性:,5 3外切酶活性:,?,能切除突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性:,（1）原核生物的DNA聚合酶分为三型,DNA-pol DNA-pol DNA-pol ,原核生物的DNA聚合酶,功能：,DNA-pol （109kD）,对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5
7、 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol ,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,DNA-pol （120kD）,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。 DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。,功能：,DNA-pol (250kD),是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,（2）常见的真核细胞DNA聚合酶有五种,DNA-pol ,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制 。,在复制过程中起校读、修复和填补缺
8、口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,表14-2 真核细胞DNA聚合酶性质的比较,表14-2 真核细胞DNA聚合酶性质的比较,真核细胞DNA聚合酶性质的比较,2、核酸外切酶的校读活性和碱基选择功能是复制保真性的酶学依据,复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。,此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。,（1）核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正,核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的。,A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱
9、基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。,DNA pol 的校读功能,（2）复制的保真性依赖正确的碱基选择,DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。,遵守严格的碱基配对规律； 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 复制出错时DNA-pol的及时校读功能。,DNA复制的保真性至少要依赖三种机制：,3、复制中的分子解链伴有DNA 分子拓扑学变化,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,（1）多种酶参
10、与DNA解链和稳定单链状态,E. Coli 基因图,解螺旋酶(helicase) 利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。 引物酶(primase) 复制起始时催化生成RNA引物的酶。 单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。,（2）DNA拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态、理顺DNA链,复制过程正超螺旋的形成：,拓扑酶的作用方式：,4、DNA连接酶,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,HO
11、,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,DNA连接酶的作用：,（一）原核生物的复制 复制起始：DNA解链形成引发体,1. DNA解开成单链，提供模板。,2. 形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。,五、DNA复制过程,E.coli复制起始点 oriC,1. DNA解链,Dna A,Dna B、 Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,2. 引发体和引物,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,复制的延长过程,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是
12、磷酸二酯键的不断生成。,OH 3,3,领头链的合成：,领头链的子链沿着53方向可以连续地延长。,随从链的合成,同一复制叉上领头链和随从链由相同的DNA-pol催化延长,复制过程简图,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,复制的终止过程,哺乳动物的细胞周期,DNA合成期,G1,G2,S,M,（二）真核生物的DNA生物合成,细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不
13、是同步起动。 复制的起始需要DNA-pol （引物酶活性）和pol （解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。,真核生物复制的起始：与原核基本相似,哺乳类动物的周期蛋白和CDK,DNA-pol 和pol 分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，DNA-pol 通过PCNA的协同作用，逐步取代pol ，在RNA引物的3-OH基础上连续合成领头链。随从链引物也由pol 催化合成。然后由PCNA协同，pol 置换pol ，继续合成DNA子链。,真核生物复制的延长：发生DNA聚合酶/转换,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代DNA,
14、随从链,引物,核小体,真核生物复制叉的延长：,线性DNA复制的末端,（三）端粒(telomere),指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。,端粒的功能：,维持染色体的稳定性 维持DNA复制的完整性,端粒的结构特点：,由末端单链DNA序列和蛋白质构成。 末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短序列。,TTTTGGGGTTTTGGGG,端粒酶(telomerase),端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶(human telomerase
15、reverse transcriptase, hTRT),组成：,端粒酶催化作用的爬行模型,逆转录酶(reverse transcriptase),逆转录(reverse transcription),逆转录酶,（四）逆转录,RNA,DNA,逆转录病毒细胞内的逆转录现象:,RNA病毒在细胞内复制成双链DNA的前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遗传信息，并可在细胞内独立繁殖。在某些情况下，前病毒基因组通过基因重组(recombination)，参加到细胞基因组内，并随宿主基因一起复制和表达。这种重组方式称为整合(integration)。前病毒独立繁殖或整合，都可成为致病的原因。,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。,以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。,试管内合成cDNA:,cDNA complementary DNA,DNA损伤（突变）与修复 DNA Damage (Mutation) & Repair,第三节,DNA突变具体指个别dNMP残基以至片段DNA在构成、复制或表型功能的异常变化，也称为DNA损伤(DNA damage)。 从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。,
