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1、第三章 酶工程,酶工程简介 酶工程（Enzyme engineering）是指通过化学方法、酶学方法和DNA重组技术改善自然酶的形成、结构和性质，提高酶的催化活性、降低成本并在大规模工业化生产中应用。 主要内容： 1 酶的制备和酶与细胞的固定化 2 酶反应器的设计和放大 3反应条件的控制和优化 .,第一节 概 述,酶工程的分类,化学酶工程：通过对酶的化学修饰或固定化处理，改善酶的性质，提高酶的效率和降低成本，甚至通过化学合成法制造人工酶，也称为初级酶工程；生物酶工程：用基因工程技术生产酶以及对酶基因进行修饰或设计性能稳定、具有新的生物活性及催化效率更高的酶，也称为高级酶工程。,一、酶的定义酶是
2、由生物体内活细胞产生的一种生物催化剂，按化学组成的不同主要分为核酸类酶（R酶）和蛋白质类酶（P酶）。,二、酶的分类与命名法1 习惯命名法底物名称： 淀粉酶、蛋白酶 催化反应性质：氧化酶、转氨酶 底物结合催化反应性质：胆固醇氧化酶、醇脱氢酶 来源：心肌黄酶、含铁酶缺点：无系统性，一酶数名或一名数酶。,2 系统命名法与分类国际生化联合会（IUB）酶学委会于1961年规定了酶的统一命名法及分类原则。 系统命名法：酶的名称由底物及反应类型两部分组成。 六大类：氧化-还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶。,三、酶的结构和特性1 酶的结构酶的组成成分 单纯酶仅由蛋白质组成的酶。 结合酶除蛋白质外
3、，还有非蛋白质的成分。 全酶=酶蛋白+辅因子 辅因子有两种：辅酶和辅基,根据酶的聚合状态，酶可以分为三类： 单体酶 寡聚酶 多酶复合体,酶的活性中心指酶分子中直接和底物结合，并和酶催化作用直接相关的部位。 组成： 由一些氨基酸残基的侧链基团组成。这些基团在一级结构上可能相聚很远，甚至可能不在一条肽链上，但在蛋白质空间结构上彼此靠近，形成具有一定空间结构的区域。 对于结合酶，辅因子常常是活性中心的组成部分。,酶活性中心的特点： 活性中心在酶分子总体积中只占相当小的部分（1-2%），相当于2-3个氨基酸。 都是酶分子表面的一个凹穴，有一定的大小和形状，但不是刚性的，而具有一定的柔性。 活性中心为非
4、极性的微环境，有利于与底物结合。 底物与酶通过形成较弱键力的次级相互作用并结合到酶的活性中心。 酶的活性部位并不是和底物的几何图形正好吻合，而是在酶与底物结合的过程中，底物分子或酶分子或它们两者的构想同时发生一定变化后才能相互契合，这时催化基团的位置也正好处于所催化底物的敏感化学键部位。,2 酶的特性 催化效率高 专一性强 反应条件温和 催化活性受到调节和控制,四、酶的来源酶作为生物催化剂普遍存在于动物、植物和微生物中，可直接从生物体中分离提纯。 酶的生产方法可分为提取法发酵法以及化学合成法。 化学法仍在实验室阶段； 提取法是最早采用且沿用至今的方法，如从动植物组织液中提取胰蛋白酶和菠萝蛋白酶
5、； 发酵法是50年代以来酶生产的主要方法，如生成葡萄糖异构酶和枯草芽孢杆菌蛋白酶等。,五、酶促动力学 六、酶的分离纯化与酶的活力测定 1 酶的分离纯化 细胞外酶和细胞内酶 在生物细胞内除了目标酶还有很多其他的酶，因此需要分离和纯化的步骤。 基本步骤： 破碎细胞膜 抽提 纯化,比活力：纯度的量度，指每毫克质量的蛋白质中所含的某种酶的催化活力，一般用单位/毫克蛋白（U/mg蛋白质表示）。酶的比活力越高，酶的纯度也就越高。纯化倍数=每次比活力/第一次比活力产率%=每次总活力/第一次总活力,2 酶的活力测定1个酶活力国际单位是指在特定条件下，1min内生成1mol产物的酶量（或转化1 mol 底物的酶
6、量）。,第二节 酶和细胞固定化,酶固定化技术发展史,20世纪60年代，以色列科学家发现酶的固定化现象。 1969年，千畑一郎等将固定化氨基酰化酶应用于生产L-氨基酸，开创了固定化酶应用于工业生产的先例； 1971年召开的第一届国际酶工程会议上，建议采用统一的英文名称Immobilized Enzyme； 1973年，固定化大肠杆菌菌体中的天冬氨酸酶连续生产L-天冬氨酸。 1986年，利用固定化原生质体发酵生产碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等相继获得成功。,一、固定化酶的制备,固定化酶的定义：固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限
7、制，而又能发挥催化作用的酶制剂。广义的固定化酶包括： 固定化辅酶；固定化细胞；固定化细胞器为了减少从微生物或者其他生物体中提取酶的麻烦，有时为了充分利用生物细胞的多酶系统，开发另外一种固定化催化剂的形式，固定化细胞。,固定化酶的特点具有生物催化剂的功能，又有固相 催化剂的功能。 可重复使用，降低成本； 反应后，酶底物产物易分开，产物中无残留酶，易纯化，产品质量高。 稳定性提高，反复使用多次后，酶的活力无明显下降； 反应条件易于控制，可以自动控制，节约劳动力。,固定化酶的制备原则,（1）必须注意维持酶的构象，特别是活性中心的构象。 （2）酶与载体必须有一定的结合程度。酶的固定化既不影响酶的原有构
8、象，又能使固定化酶能有效回收贮藏，利于反复使用。 （3）固定化应有利于自动化、机械化操作。这要求用于固定化的载体必须有一定的机械强度，才能使之在制备过程中不易破坏或受损。 （4）固定化酶应有最小的空间位阻。 （5）固定化酶应有最大的稳定性。在应用过程中，所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反应。 （6）固定化酶的成本适中。,酶和细胞固定化方法酶和细胞固定化方法载体结合法 交联法 包埋法网格型 微囊型物理吸附法 离子结合法 共价结合法 热处理（细胞）,酶和细胞固定化模式,结晶法,使酶结晶从而实现固定化的方法。 载体是酶蛋白本身。 对于活性低的酶，可以提高酶浓度和单位体积的活力。 局限性：在重
9、复使用中，酶有损耗。,（ 1 ）吸附法,通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法，是固定化中最简单的方法。 吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。,物理吸附法,物理吸附法(physical adsorption)是通过非特异性物理吸附作用将酶直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。包括范德华力、疏水相互作用、氢键。 物理吸附法常用的载体： 有机载体：纤维素、胶原、淀粉及面筋等； 无机载体：活性炭、氧化铝、皂土、多孔玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。,离子吸附法,离子吸附法(ion adsorption)是通过离子键使酶与含有离子交换基团的水不溶性载体相结合的固定
10、化方法。 阴离子交换剂： DEAE-纤维素，DEAE-葡萄糖凝胶等 阳离子交换剂： 羧甲基纤维素等此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、-淀粉酶、纤维素酶等，在工业上用途较广。 1969年最早用于工业化生产的固定化氨基酰化酶：使用多糖类阴离子交换剂DEAE-葡萄糖凝胶固定化。,吸附法的优点： 操作简单，条件温和，吸附剂可再生反复使用。吸附法的缺点： 酶和载体的吸附力比较弱，容易在不适宜的pH、高盐浓度、高底物浓度或高温条件下解析脱落，易导致催化活力的丧失和污染反应产物等后果。,（ 2 ）包埋法,包埋法（entrapment）是将酶包埋在高聚物的细微凝胶网格中或高分子半透膜内的固定化方法。 前者又
11、称为凝胶包埋法，酶被包埋成网格型；后者又称为微胶囊包埋法，酶被包埋成微胶囊型。 基本原理：单体和酶溶液混合，再借助引发剂进行聚合反应，将酶固定于载体材料的网格或微囊中。,网格型：包埋在高分子凝胶细微网格中。将块状聚合形成的凝胶切成小块，或直接包埋在珠状聚合物中，后者可以使固定化酶机械强度提高10倍，并改进酶的脱落的情况。常用的材料： 聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等合成高分子物质 淀粉、明胶、胶原、海藻酸和角叉胶等天然高分子物质。,微囊型：包埋在高分子半透膜中。膜既能形成类似细胞内的环境，又能阻止酶的脱落或直接与微囊外的环境接触；小分子底物能迅速通过膜与酶作用，产物也能扩散出来。,制备方法：1
12、 界面沉淀法：利用高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成膜将酶包埋。 2 界面聚合法：将亲水性单体和疏水性单体利用界面聚合的原理包埋酶的方法。 3 纤维包埋法（二级乳化法）：酶溶液先在高聚物有机相中乳化分散，乳化液再在水相中分散形成次级乳化液，当有机高聚物溶液固化后，每个固体球内包含多滴酶液。,包埋法的优点 反应条件温和，不需要与酶的氨基酸残基进行反应，不改变酶的结构； 酶回收率高；缺点： 包埋时发生化学聚合反应，酶容易失活（微囊型），要要巧妙设计反应条件。 由于高分子网格的扩散阻力，会改变固定化酶的动力学行为，降低酶活力。仅适用于小分子底物和产物的酶。,（ 3 ）交联法,交联法（cro
13、ss-linking）是使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法。 常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、异氰酸衍生物等。 戊二醛和酶蛋白中的游离氨基发生Schiff反应，形成薛夫碱，从而使酶分子之间相互交联形成固定化酶。,交联法的特点 反应条件比较激烈，固定化的酶回收率比较低，但是降低交联剂的浓度和缩短反应的时间有利于固定化酶比活力的提高。交联剂一般价格昂贵，所得到的固定化酶活力较低，不易成型，一般作为其他固定方法的辅助手段，如与吸附法和包埋法联合使用，起到加固结合的作用。,（4 ）共价键结合法,共价键结合法(covalent binding）是将酶与聚合物载体以共价键结
14、合的固定化方法。常用方法归纳起来有两类： 1 将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应； 2 在载体上连上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。,酶蛋白上可供载体结合的功能基团,（1）酶蛋白N末端的-氨基或赖氨酸残基的-氨基。 （2）酶蛋白C末端的-羧基、天门冬氨酸残基的-羧基以及谷氨酸残基的-羧基。 （3）苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯环。 （4）其他：半胱氨酸残基的巯基；丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基；组氨酸残基的咪唑基；色氨酸残基的吲哚基。,参加和载体共价结合的基团必须不是活性中心的基团，也不是维持酶蛋白空间结构必须的基团。,共价结合载体的特点,1 可以在温和条件下与酶蛋白发生偶联反应；
15、 2 具有一定的机械强度和较大的表面积。常用的载体有： 天然的高分子物质：纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖、淀粉及其他衍生物； 无机物：陶瓷、玻璃等； 人工合成的高聚物：甲基丙烯酸共聚物、顺丁烯二酸酐和乙烯的共聚物、氨基酸共聚物及聚苯乙烯等。,载体活化的主要反应,重氮法 叠氮法 溴化氰法 芳香烃化法,重氮法,重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法，是共价键法中使用最多的一种。 常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸的共聚体和聚丙烯酰胺衍生物等。,具有芳香族的水不溶性载体在稀盐酸和亚硝酸钠中进行反应，成为重氮盐化合物，然后再与酶发生偶合反应，得到固定化酶。 酶蛋白中
16、的游离氨基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸中的酚基参与此反应。,叠氮法,即载体活化生成叠氮化合物，再与酶分子上的相应基团偶联成固定化酶。 含有羟基、羧基、羧甲基等基团的载体都可用此法活化。如CMC、CM-sephadex（交联葡聚糖）、聚天冬氨酸、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等都可用此法来固定化酶。其中使用最多的是羧甲基纤维素叠氮法。,溴化氰法,即用溴化氰将含有羟基的载体，如纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联，制成固定化酶。 任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰法来活化。,烷基化和芳基化法,以卤素为功能团的载体可与酶蛋白分子上的氨基、巯基、酚基等发生烷基化或芳基化反应而使酶固定化。 此法常用的载体有卤乙酰、三嗪基或卤异丁烯基的衍生物。,对于无机载体，可用直接法和涂层法（用活化物的聚合物如白蛋白或葡聚糖涂层）。,共价结合法的优缺点,优点：共价键的键能高，酶和载体之间的结合相当牢固，即使用高浓度底物溶液或盐溶液，也不会使酶分子从载体上脱落下来，具有酶稳定性好、可连续使用较长时间的优点。 缺点：载体活化的难度较大，操作复杂，反应条件较剧烈，制备过程中酶直接参与化学反应，易引起酶蛋白空间构象变化。,
