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1、1,回顾,Functional analysis,State 1,State 2,2DE,PMF,MS/MS,LC-MS/MS,Database search,Differential analysis,?,2,第四章 电泳图谱的图像分析及 蛋白质消化技术,3,蛋白质表达谱,使用2D凝胶的比较蛋白质组学比较蛋白质组学最常用的方法是用两个样品进行2D-SDS-PAGE，比较蛋白质点的图型。研究人员已进行了大量工作来开发分析2D凝胶蛋白质点图型分析软件工具。此外，也开发出保存这些信息的大批数据库。,4,双向电泳分析软件,ImageMaster 2DElite （MelanieTM） PDQuest
2、 6 0 英国公司Nonlinearn Dyanamics Ltd的Progenesis 德国Decodon GmbH的Delta 2D等,5,图像分析的基础：使用文件扫描仪，但最好使用CCD获得图型。程序首先评估凝胶的“特征”，他是指与凝胶本底相比显现的重要不同。“特征”相当于凝胶上的蛋白质点。可以通过光密度（OD）、大小和体积（整个蛋白质点面积上的OD）来鉴定特征。这些鉴定参数是一块凝胶中或多块凝胶之间特征比较的基础。,6,第一节 电泳图谱的图像分析,掌握： 蛋白电泳图像分析系统 熟悉： 使用PDQuest软件进行蛋白质点的自动检测，匹配 和分析 了解： 二维电泳蛋白谱数据库,7,电泳图谱
3、的图像分析简介 what can we get from image analysis?,双向凝胶电泳技术是目前蛋白质组研究的主要技术之一, 双向电泳根据等电点和分子量可一次性分离数千种蛋白质，经染色后蛋白质再PAGE上可形成密度不同、分布不均的复杂点图谱。如何有效的对双向凝胶电泳图像分析，如何对图谱上的蛋白质点进行检测、定量、比较、分析和归类，挖掘有价值的蛋白质点的信息是双向电泳分析软件所要解决的问题。,8,凝胶的图像处理分析及细胞蛋白谱的建立,典型流程凝胶图像的扫描： 图像加工： 斑点检测和定量： 凝胶配比： 数据分析： 数据呈递（report） 2-DE数据库的建立：,9,PDQuest
4、 软件简介,PDQuest软件是显示（imaging）、分析（analyzing）双向电泳图谱数据库查询的一个软件包硬件：一定的电脑配置,Pentirm 166处理器，64M内存，3G硬盘，1024*768分辨率 ，256色，SCI接口，windows操作系统软件： PDQuest双向凝胶图像分析软件，Bio-Rad Laboratory,Hercules,CA,10,PDQuest 软件的使用,以PDQUEST 2-D分析软件为例将双向电泳分析的基本实验过程做一简单介绍。,11,PDQuest 软件,PDQUEST 2-D分析软件系统和其他2-D分析软件系统一样，包括： 一 图象采集与加工：
5、 二 斑点检测 三 斑点匹配 四 数据分析及输出,12,PDQuest 软件的使用,http:/ 图象采集与加工 (editing images),14,1、扫描：凝胶染色后用扫描仪扫描，透射模式，全彩RGB,分辨率为400dpi-800dpi，尽量排除气泡，文件以tiff格式保存。 2、图片加工： 在PDQUEST 2-D分析软件中打开以tiff格式保存的文件可以。（单击“打开文件”图标和“File”菜单并选择“Open”命令，选择保存2-D图象文件的磁盘、路径和文件名，双击文件名或单击“Open”以打开2-D图象文件，此时tiff格式保存的文件会自动另外创建一个为PDQUEST 2-D分析
6、软件自定义的文件格式2D Scan。） 单击工具栏上的control the image display 图标，会出现一个对话框，通过改变此对话框的High 和Low的值以改变明亮度。,15,16,用工具栏的crop可以切割掉凝胶边缘没有蛋白质点的部分，以减少分析的复杂性，但要注意对你要分析的多块凝胶图像最好是切割成同样大小。 （在操作时先选择其中的一个凝胶图象并选定要切割的区域，然后在imageadvance cropsave crop settings下保存crop的设定条件并输入保存的名称，其他的图象切割时在imageadvance cropload crop settings中选定先前
7、保存的名称即可 ）,17,图象采集与加工后就要进行斑点检测，PDQUEST 2-D分析软件通过一个称之为“蛋白质斑点检测向导（spot identification wizard）”的程序来实现的。,二 、斑点检测 (spots detection),18,单击“spot”菜单，选择“spot identification wizard”程序。 该程序首先需人工设定检测参数如最小斑点、最弱斑点、最大斑点和背景值,然后程序进行自动检测并可调节检测的灵敏度，若检测效果不理想，该步骤可反复进行。程序允许人工调节脱尾（streaks）、背景、斑点（speckles）和其他一些选项等。 这些参数设好后单
8、击Find spot centers,其结果在凝胶图象会显示检测到的斑点会用“ 字（Spot Crosshairs）”表示，检测的蛋白质斑点应尽量与肉眼观测的相符。 在Parameter Set 项输入保存的名称，蛋白质斑点的参数可被保存，并能用保存的参数自动检测所有2-D凝胶中蛋白质斑点，单击Process all gels，会出现一个Auto-detect spots窗口，其中可以选择需要进行斑点检测的凝胶图象（这些凝胶图像需事先打开）。 蛋白质斑点检测完了之后，软件会自动创建另外两种格式分别为gel image 和gel spot。,19,20,21,由于在进行斑点检测时会错误的识别一些
9、蛋白质斑点，比如将一些污染的非蛋白质点识别为蛋白质点、将本来是一个蛋白质点识别为两个蛋白质点或者反之。所以在匹配之前最好进行处理，同时将gel scan 、gel image 和gel spot图打开，然后单击edit spot tool，出现一个对话框，此对话框中有增加斑点（make a spot at cursor）, 删除斑点（remove spot at cursor）,合并斑点（combine spot in box）等图标，可根据你的目的而选择其中一个图标进行相应的斑点处理。这些处理只能在gel image图象中处理，但相应的在gel spot图象中会同时得到显示。,22,23,蛋
10、白质斑点检测完了之后，为了比较和分析不同凝胶中蛋白质斑点的改变，PDQUEST 可以建立一个Matchset。 单击matchcreat matchset, 出现一个Matchset的对话框，输入文件名称，保存路径，选择（select）或上载（load）gel spot 图像的文件名，然后单击creat, 出现一对话框，选择其中的一个图象做为参考图象（standard member）, 整个Matchset用单个窗口（signal window）来表示，其中的亚窗口（subwindow）分别用来表示参考图像（用REF来表示）和成员胶（member gel）图像。,三 、斑点匹配(Matchin
11、g spots),24,25,26,Matchset 建成后，接着便是设立标志点（landmark）,它的作用是对整个凝胶上蛋白质斑点进行排列（align）与定位（position）以便进行匹配（match）。 单击工具栏中的match tools图标会出现一个窗口，其中有 landmark, unlandmark, match gel, match all gels等斑点匹配的工具, 在match菜单中也有这些工具。 标志点应选择分辨良好，且所有成员胶上均出现的蛋白质斑点，并尽量避开蛋白质斑点聚集的地方，最好在不同的放大倍数下确定该蛋白质斑点为所有成员胶上同一个蛋白质斑点。至少要设立两个标志
12、点后便可利用PDQUEST的自动匹配功能来完成不同凝胶上的蛋白质斑点的匹配了。一般设立的landmark斑点个数为总斑点的10%左右，要用肉眼检查每一个应该能匹配上的斑点是否匹配上了。,27,28,29,对错误匹配的蛋白质斑点或没有识别到的匹配可进行手工方式编辑。在这里也可以进行编辑斑点功能，单击viewinterchange all images, 这样所有的成员胶和参考胶有Gel spot 状态下变成了Gel image, 而在Gel image 状态下可进行Edit Spot Tools 以编辑蛋白质斑点。,30,31,四 、数据分析及输出（analysis and report）,32
13、,为了分析蛋白质斑点之间差异表达，PDQUEST提供了多个分析程序，包括蛋白质斑点量(Quantity)分析，散点图工具（Satter Plot Tool） ,量的柱状图分析（Graph）等在内的多种分析程序。,33,量的分析,打开Matchset，单击DatabaseAnalysisCreate Analysis Set, 然后再单击参考图，就会出现一个对话框, 输入名字（Name）, Type有多种选项,要做量的比较就选Quantitative。,34,35,比较（Compare）形式有两种，一种是Gel, 可以单个的胶两两互相比较(只能是成员胶和参考胶进行比较)，另一种是Group，可以
14、将同一样品的多块胶做为一组（这在Database Replicate GroupCreate Group下可以创建组），然后再组之间两两比较。然后再选择A 和B，分别表示两块胶或者是两组胶。,Replicate Group,36,37,38,在Select Spots Which are 中可以选择Increased, Increased or Decreased 或者是Decreased 等，激活选项后可以输入倍数关系, 默认的是2 times, 可以输入其他数值， 如3 times。参数设好后就单击go, 在参考胶上就会出现黄色圈标记的蛋白质斑点，如果你选择是Increased BA 2
15、times, 那么这些黄色圈标记的蛋白质斑点即为在量上B大于A 两倍的蛋白质点.,39,为了矫正银染对蛋白质点定量分析的影响，所有点的含量通过单个点的光密度值比胶上所有点光密度质而正常化（Normalize）, 单击EditNormalize, 出现一对话框，选择左上角Enable Normalize，下面的窗口被激活，,归一化 Normalization,40,41,散点图工具 Scatter plot,42,43,单击Reports 下的Scatter plot，会出现散点图分析的对话框，可以选择x, y轴，分别代表一块胶，Markers 下可以选择倍数，下面的散点图即显示了两个2-D胶图
16、像中蛋白质点之间的相关性，上面会显示二者的相关系数，在Reports Scatter plots 下可以将所有的凝胶图之间的相关图都打印出来。,44,45,量化柱状图 Graphs,46,单击ReportsMore GraphsPage Graphs, 在有边会出现一对话框，显示所有蛋白质点在不同胶上的量化柱状图，如果要显示所要分析的蛋白质点的量化柱状图，则在对话框的Input下选择Analysis set, 出现一对话框，然后选择分析的名称即可。在ReportsQuantity Graphs下可输出所有的蛋白质点（All Match Spots）或者是特定分析的蛋白质点（Specificd Analysis Set）在不同胶上的量化柱状图。,47,48,Proteomics Ananlysis in the Control and Experimental,49,应用,材料：,50,无腔眼金鱼胚胎,正常眼金鱼胚胎,51,
