生物发酵培养技术

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1、生物制药工艺学,发酵工程制药,第一节：微生物细胞工程（发酵工程制药）生产原理第二节：利用微生物进行药物的生产实例,第一节：微生物工程（发酵工程制药）生产原理,人工培养的微生物，通过体内的特定酶系，经过复杂的生物化学反应过程和代谢作用，最终合成人们所需要的药物如抗生素、氨基酸、有机物、维生素。这种方法称为微生物细胞工程。,一：最常用的工业微生物 二：微生物的培养技术 三：细胞浓度的测量 四：微生物发酵的工艺学原理 五：工业微生物菌种的制备和改良 六：发酵生产过程 七：灭菌技术 八：分离纯化技术 九：干燥技术,讲解分章节内容,一：最常用的工业微生物,1：细菌 2：放线菌 3：霉菌 4：酵母 青霉菌

2、,1：细菌,（1）醋杆菌属-醋化醋杆菌（Acetobacter aceti）可以将酒精转变为醋酸。弱氧化醋杆菌（Acetobacter suboxydans）可以将山梨糖醇转变为山梨糖。 （2）乳杆菌属-德氏乳杆菌（Lactobacillus delbriiekii）可以将糖转变为乳糖。 （3）链球菌属（Streptococcus）-用来生产乳酸。 （4）片球菌属（Pediococcus）-用来生产乳酸。 （5）串珠菌属（Leuconostoc）-用来生产乳酸。 （6）芽孢杆菌属-枯草杆菌（Bacillus subtilis）可以用来生产-淀粉酶、肌苷、鸟苷等核苷。 （7）梭菌属-丙酮丁醇梭菌

3、（Clostridium acetobutylium）用来生产丙酮、丁醇。 （8）大肠杆菌（Escherichia coli）用来作为基因工程的克隆菌。,2：放线菌,有以下分类,红霉素链霉菌（S.enytnreus） 能产生红霉素。,卡那霉素链霉菌（S.kanamycetieus） 能产生卡那霉素,金霉素链霉菌（S. aureofaciens） 能产生金霉素。,委内瑞拉链霉菌（S.veneznelae） 能产生氯霉素,3：霉菌,（1）曲霉属-米曲霉（Aspergillus oryzae）能产生高峰淀粉酶。 （2）黑霉属（A.niger）-能产生酸性蛋白酶、蛋白酶。 （3）青霉属-点青霉（Pen

4、icillium.notatum）、产黄青霉（P.chrysogenum）能产生青霉素。橘青霉（P.citrinum）可产生核酸酶P1。,4：酵母,酵母属-最常用的是酿酒酵母，用于进行酒精发酵。,二：微生物的培养技术,（一）培养基组成 （二）培养基的分类 （三）培养方法 （四）培养条件,（一）培养基组成,1、碳源 一般为蔗糖、葡萄糖。 工业用碳源为淀粉水解液、 糖蜜、干薯粉、甲醇、乙醇、 石油、醋酸等等材料。,2、氮源 主要有硫酸铵、 尿素、豆饼水解液。,3、无机盐 磷酸二氢钾、 磷酸氢二钾 七水硫酸镁。,4、微量生长因子 生物素 硫铵素 玉米浆最常用,（二）培养基的分类,1、细菌用培养基 以

5、肉汤+蛋白胨+酵母膏作为其组成物质。,2、酵母、霉菌用培养基-以曲汁和麦芽汁为最常用 将米曲（或者麦芽汁）添加适量水，在55下糖化2小时， 经过过滤，滤液稀释至糖度10度，备用。,3、培养霉菌则专用蔡氏霉菌培养剂 蔗糖20-30g、硝酸钠3g、磷酸二氢钾1g、氯化钾0.5g、 七水硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、蒸馏水1L。,4、工业用培养基-定量组成培养基配方,（三）培养方法,按培养基类型分为-固体培养法、液体培养法。 按操作方式分为-分批培养、半连续培养、连续培养。 按氧气供应分为-需氧培养、厌氧培养。,下面分别介绍其中重要的5种方法：,1、浅盘培养,该方法选用于固体培养法、也适用于液

6、体培养法。其方法是将固体或者液体培养基盛于不锈钢制的浅盘内，接种菌种，在保温室内培养。,2、厚层通风培养,此方法用于固体培养。这种方法的优点是培养量大，并且节省劳动力。国内酱油厂多采用此法。,所用设备是在水面建造大型水泥槽 水泥槽底部铺上多孔板 板上放置固体培养基 接种之后 将空气由多孔板下部通入培养基内,3、液体通风深层培养,简称深层培养法，是最先进的方法。在我国，抗生素、柠檬酸的生产常常采用此法。,4、厌氧培养,（1）简单的方法是，用一般的发酵槽，撤去通风设备。 （2）真正的方法是必须把氧气抽除，采用真空泵来抽去氧气。,较为先进的方法是 加拿大的BBL Gas Pak 150的厌氧培养器

7、采用由水发生氢气的方法 此氢气与氧气反应，遂形成真空。,5、大规模发酵生产,一般采用几千升、几万升的培养罐。采用逐步扩大法生产,将酵母进行 斜面培养,移至500L的种子罐 作为工业发酵的种醪,移至含5ml曲汁的试管之中 30培养24小时。,移至10L的曲汁卡瓦罐中 30培养48小时。,移至500ml的巴士瓶中 30培养48小时,最后进行 大规模培养,（四）培养条件,1、培养基浓度 2、温度 3、PH值 4、氧气 5、氮源 6、微量因子,1、培养基浓度,一般为含葡萄糖10%最高可以通过流加法达到15%。,2、温度,一般为30-33超过33时应该进行冷却。,3、PH值,（1）酵母菌为PH=4.0-

8、6.0 （2）细菌的PH=6. 0-7.5 （3）霉菌生产的PH值则在4.0-9.0之间。,4、氧气,微生物的类别有需氧菌、厌氧菌、兼性菌三种。 各自需要不同的氧气条件。,测定培养剂的溶解氧是一个技术关键。,5、氮源,一般情况下，是以使用尿素为最适合，因为一则尿素可以维持发酵液的PH值不变，同时又能够供给氮源的需要。,使用硫酸铵时， 由于其残留的硫酸根使得发酵液PH值变小 必须用碱性物质中和,6、微量因子,主要是指维生素，它是微生物生长所不可缺少的营养成份所需。,很多天然的碳源与氮源之中 一般均含有众多的维生素物质 配制培养基时一般不需另外添加,三：细胞浓度的测量,（一）直接测定法（二）间接测

9、量法,（一）直接测定法,特点是直观精确,4 浊度法,3 平板计数法,2 显微计数法,1 细胞干重法,1、细胞干重法,将一定体积的培养液离心，收集细胞，洗涤、干燥、进行称重。,不足之处是此方法不适用于统计含有不溶性沉淀物的培养液。,2、显微计数法,利用显微镜和血球计数器、测定单位体积内培养液中的细胞个数。,缺点是： （1）不适用于丝状生物体的计数。 （2）不能区别活细胞和死细胞。 （3）由于细菌太小，不适于进行计数。,3、平板计数法,将样品用无菌生理盐水进行逐一数量级的稀释然后取一定量的稀释液涂于琼脂平板培养基上，经过一段时间的培养，从平板上长出的菌落数量，可以计算出原培养液中微生物的浓度。,其

10、优点是 可用于测定活细胞的浓度,4、浊度法,由于培养液的浊度和光密度与培养液中的细胞浓度成正比关系，因此，可以通过分光光度计法用600-700nm波长进行测定。 其优点是快速、准确。,（二）间接测量法,1、测定细胞成份-可以通过测定培养液中蛋白质、DNA、RNA的含量来确定细胞的浓度。 2、培养液中细胞虚体积的测定-将一定体积的培养液在一定速度下离心，由于不溶性成份的密度较大，经过离心后，一般均沉入底部，而活细胞则呈现出半悬浮状态，因此，沉降物总量-沉淀物的数量=细胞的估算量。 3、粘度-培养液的粘度与所含的细胞数量有关。 4、利用培养过程中产生热量的多少来测定细胞的数量。 5、利用发酵过程中

11、营养物质的消耗量来测定细胞的浓度。 6、利用最终产物的合成数量，来测定培养液中细胞的数量。 7、利用荧光素测定细胞中ATP的数量，测定活细胞的浓度。,四：微生物发酵的工艺学原理,（一）分批培养 （二）连续培养 （三）其它培养方法,（一）分批培养,3点,1、分批培养的定义,2、分批培养的生长过程,3、分批培养过程中影响细胞生长的因素,1、分批培养的定义,分批培养是一种间歇式的培养方法，在每一批次的培养过程中，不再加入其它营养物料。待生物反应进行到一定程度之后，将全部培养液倒出、进行后道工序的处理。,为了提高生物反应器在分批培养中的效率 通常采用多级分批培养的办法。 即在小型生物反应器中接入少量种

12、子 经过分批培养，来获得较大数量的细胞作为种子 再转入到大型生物反应器中,分批培养的设备要求较少 操作也较简单 工业微生物生产中经常采用,2、分批培养的生长过程,培养中的细胞经过4个生长阶段：（1）延迟期 （2）指数生长期 （3）静止期 （4）衰亡期,1、延迟期 （1）种龄越长，延迟期越长， （2）接种量越少、延迟期越长,4、衰亡期 营养物质消耗贻尽 培养液中有害物质积累太多 导致培养液中的细胞开始死亡， 称为衰亡期。,3、静止期 随着营养物质被逐渐消耗、 细胞的生长速率开始下降， 最终细胞浓度不再增加， 称为静止期。,2、指数生长期 细胞的倍增时间 指细胞浓度增长一倍所需要的时间。 微生物的

13、倍增时间一般为0.51小时。,3、分批培养中影响细胞生长的因素,共有以下5种影响因素：（1）营养物质浓度 （2）温度 （3）PH值 （4）溶解氧浓度 （5）产物,（1）营养物质浓度,营养物质的限制性浓度-当某一种营养物质的浓度下降到一定程度之后，就会影响细菌的生长，此时的浓度就称为营养物质的限制性浓度。营养物质的最大浓度-当某一种营养物质的浓度超过一定程度之后，也会对细菌的生长产生抑制作用。,（2）温度,当培养温度偏低时，细胞的生长速率较低， 随着温度的升高，细菌的生长速率也随之加快， 当温度超出一定范围时，由于蛋白质等细胞结构的变性，导致细菌生长速率的急速下降。,微生物细胞的最适生长温度并不

14、等于其代谢产物的最佳生产温度。 因此在具体的生产过程中， 培养的前期常常将温度调控在有利于细胞生长的区域， 而在后期则常常将温度转到最佳的生产温度， 以获得较多的产物,根据培养温度的要求的不同，可以将微生物分成-低温菌，中温菌，高温菌。采用高温菌生产有许多优点： （1）高温菌所生产出的酶，其热稳定性较好。 （2）高温菌的培养温度较高，细胞的生长速率较大。 （3）不容易发生杂菌污染。 （4）在大规模生产时可以节约冷却水、同时能够减少动力消耗。,发酵温度调控技术,（3）PH值,细菌适宜于在中性、弱碱性的条件下生长。酵母菌、霉菌则喜酸性环境。乳酸菌、醋酸菌对于低PH值环境有着很好的耐受性。,（4）溶

15、解氧浓度,不同的培养过程对于溶解氧有着不同的要求应该根据具体情况来加以控制。,空气过滤片,（5）代谢产物的抑制作用,细胞的代谢产物会影响到细胞的生长，这种现象称作产物抑制作用。 而代谢产物多数就是生物制物的原材料。因此，在实际生产过程中要设法定期收集细胞的代谢产物,（二）连续培养,1、连续培养方法的优缺点2、连续培养法的分类,细菌连续培养的设备简化示图,1、连续培养方法的优点 （1）细胞生长速率较高。 （2）连续培养可发使得培养液达到一个稳定状态,2、连续培养方法的缺点 （1）连续培养延续的时间长，发生杂菌污染的概率也就增加 （2）长时期进行连续培养，细胞发生变异、质粒丢失、基因突变、 （3）

16、细菌株生产性能退化的现象也就比较突出,3、连续培养法的分类,可以分为以下3类：（1）单级连续培养 （2）细胞回流式的单级连续培养 （3）多级连续培养,（1）单级连续培养,新鲜培养基的加入速率=培养之后的物料抽出速率。这种培养方法称为单级连续培养法。 在单级连续培养方法之中，发酵液体积保持恒定，生物反应器中各组分分布均匀。 单级连续培养是一种最简单的连续培养方法。,（2）细胞回流式的单级连续培养,将单级连续培养流出液中的细胞加以浓缩，然后再送回到生物反应器中，这种方法称为细胞回流式的单级连续培养。 细胞回流式的单级连续培养相当于不断地对生物反应器进行接种，有利于提高连续培养的效率。,（3）多级连续培养,将几个生物反应器串联起来，第一个反应器的流出液作为第二个反应器的流入液，第二个反应器的流出液又作为第三个反应器的流入液，这种培养方式就称为多级连续培养法。,