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1、钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件第一章 蛋白质的分离与纯化钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件 蛋白质分离纯化的一般原则（掌握） 分配层析的基本理论（重点掌握） 蛋白质的层析分离技术离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等主要掌握操作要点及操作过程的注意事项 蛋白质的电泳分离技术不连续系统原理（重点掌握）SDS-PAGE技术（重点掌握）、IEF（一般了解） 蛋白质的浓缩（了解）钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件第一节 蛋白质分离纯化的一般原则钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件钻井液性能及其测试组织损伤
2、与修复实验分析课件组织行为学课件钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件 蛋白质纯化的一般设计原则1. 材料的选择与破碎2. 建立蛋白质的活性测定方法3. 分离纯化应遵循分级分离、先粗后细的原则4. 分离纯化条件钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件根据实验目的选择合适的材料，应遵循： v 目的蛋白含量及生物活性尽可能高v 材料来源方便、成本低、易操作v 可溶性及稳定性要尽可能好 材料的选择钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件注意：不同的生物体、不同生理状态、不同组织细胞的蛋白
3、质含量和分布有很大差异预处理：将不必要的结缔组织、脂肪组织等在尽可能接近生命状态下剔除，处理后应立 即使用或在冷库中保存 钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件 细胞的破碎先要将细胞和组织破碎，使蛋白质充分释放 出来 v 机械法匀浆：破碎机体软组织最常用方法之一 组织捣碎：注意维持低温环境研磨：破碎单一细胞的有效方法，主要用于 细菌、酵母等的破碎 钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件v 物理法超声法：输入高能超声波可以破碎细胞，破碎效率取决于声频、声能、处理时间、细胞 浓度及细胞类型等 在处理少量样品时操作简便、效率高，液量损失少，适于实验室使用注意:
4、 超声波产生自由基团和造成的溶液温度升高，可造成敏感的活性物质变性失活，另 外噪声也比较大钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件反复冻融法：由于在此过程中易使活性蛋白失活，故适用于提取非常稳定的蛋白质冷热交替法：绝大多数细胞被破坏，一般适用于从细菌或病毒中提取蛋白质低渗裂解：是指无胞壁细胞在低渗溶液中通过渗透张力作用裂解的方法，常用于红细胞的裂解 钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件v 化学法有机溶剂法：有些有机溶剂(如苯、甲苯等)可以改变细胞壁或膜的通透性，使内含物有选择性的渗透出来表面活性剂(去垢剂)：常用的有十二烷基磺 酸钠、TritonX-10
5、0、去氧胆酸钠等 酶解法：必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶 钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件v 特异、快速、精确、可重复、经济v 总蛋白含量v 蛋白质比活性（specific activity）v 得率钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件v 利用溶解度的差异分离盐析法：最经典的方法，常用来进行粗分离 常用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠等，其中应用最广的是硫酸铵 影响盐析的因素很多，如pH、温度、蛋白质浓度等都会影响各种蛋白质的盐析点 钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件 盐析钻井液性能及其测试组织损伤与
6、修复实验分析课件组织行为学课件硫 酸 铵 沉 淀钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而减少氨基酸侧链基团的解离，降低蛋白质分子表面电荷，使蛋白质分子聚集导致溶解度的降低；另外有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出 钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件温度：在一定温度范围内(040之间)， 大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加等电点法：当蛋白质处于等电点pH时，蛋白质的净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之 间没有静电斥力而趋于凝集 (aggregation)和沉
7、淀 (precipitation)，它的溶解度达到最低 钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件等 电 点 沉 淀钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件 v 根据分子量的不同分离透析(dialysis)和超滤(ultrafiltration)：是利用 蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质 和其它小分子物质如无机盐、单糖、水等分开 平衡离心法：根据蛋白质分子大小、形状不 同进行分离的技术凝胶过滤 (gel filtration)：又称分子筛层析 (molecular sieve chromatography)，这是根据分子大小分离蛋白质混合物的最有效方法
8、之一 透析过程钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件v 根据电荷的不同分离电 泳区带电泳：如醋酸纤维薄膜电泳，PAGE等 等电聚焦 (isoelectric focusing, IEF) ：具有更高分辨率的电泳技术 毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE) ：在 细孔管或毛细管中进行电泳分离。柱效高、分析 时间短，所用样品量及试剂消耗少，操作模式多 ，可以进行在线检测和自动化 Agilent 3D CE 毛细管电泳系统 离子交换层析 钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件v 亲和层析亲和层析法可在温和条件下操作，纯化过程简
9、单、快速、分辨率高，对分离含量少且性质不稳定的生物活性物质极为有效 注意：应该尽量减少纯化步骤，缩短操作时间钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件目的：避免目的蛋白的变性，保证其生物活性v 缓冲液 (buffer)v 盐、金属离子和螯合剂 v 还原剂 v 去垢剂 (detergent)v 蛋白酶抑制剂 v 蛋白质的环境因素钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件第二节 层析的基本理论1906年 M.Tswett Adsorption Chromatography1941年 Martin and Synge Partition ChromatographyP
10、late theoryRate theory钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件 假设有两种互不混溶的溶剂S和M，将A物质溶于一定量的S溶剂中，再加入一定量的M溶剂 A物质在两相中相互扩散 A物质在两相中达到了平衡(在同一时间内，进出两相的A物质的分子数完全相等)时，其分配系数为常数 一、分配定律CAS 分配定律表明：v 一定的条件下，一定的物质其K值不变v 条件改变其K值随之改变v K值大于1，物质在S相中的浓度大于其在M相中浓度CAM= K钻井液性能及其
11、测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件二、分配层析的机理假设有两种物质，在一定的条件下，它们的分配 系数K不同，则通过一根分配层析柱可以将它们分离。为了便于讨论，我们做如下几个假设：（1）层析柱可分成许多层， M是流动相， S是固定 相，M和S是互不混溶（2）分配层析柱中，每一层左右相通，层与层之间互不相通，也就是说在层析柱中只有横向扩散而无纵 向扩散分配层析柱理论塔板示意图钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件（3）在分配层析柱中，溶质在两相中达到分配平衡的速度很快，并且A物质的存在不影响B物质的分配性质，反之亦然（4）在该溶剂系统中，A和B两物质的分配系数分别设为
12、：KA =CAS CAM= 1KB =CBS CBM= 1/3钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件如果在层析开始时，在第一层的S相中同时加入A和B两种物质，加入的量均为1。根据分配定律，M加入后，在两相中立刻进行分配，并且很快达到分配平衡。第一次分配前后A和B物质在S和M相中的量为：A和B物质在层析柱中1. 分配10次；2. 分配20次；3.分配30次钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件二者之间总是存在着一定的偏差，这是因为：层析柱中总是或多或少地存在着纵向扩散层析过程不可能在绝对分配平衡的情况下进行 理论曲线和实际洗脱曲线是否相符？因此，通常实际的
13、洗脱曲线都比理论曲线低而宽钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件 Martin和Synge计算了硅胶柱的理论塔板数，求得一个理论塔板的高度为0.002厘米 Verzele计算为0.02厘米 1厘米的层析柱最少有50个理论塔板，那么，在一根20厘米的层析柱上最少可以进行1000 次分配。 一根分配层析柱上到底能进行多少次分配 ？钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件塔板理论的要点： 分配层析柱象分馏柱一样可以分成很多层，每层为一理论塔板，其高度为理论塔板高度。在一定的条件下，一根分配层析柱的理论塔板数是一定的 在分配层析柱中，物质只有横向扩散，没有纵向扩散
14、，而且在两相间达到分配平衡的速度很快 体系中其他物质的存在不影响待分离物质的分配。待分离物质的存在也不影响其他物质的分配 在分配层析柱上，物质在各个理论塔板中的含量可通过计算求得三、塔板理论钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件第三节 蛋白质的层析分离层析柱泵系统（缓冲液）检测器（记录仪）部分收集器液相层析的基本装置钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件一、离子交换层析 (ion exchange chromatography) 原理：利用生物大分子与具有相反电荷的离子交换剂之间相互作用不同而进行的分离 类型：v 阴离子交换剂 (anion-exchan
15、ge chromatography) v 阳离子交换剂 (cation-exchange chromatography) 钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件v 样品的准备v 剂型的选择v 离子交换剂的预处理v 装柱(样品体积的2-5倍）v 柱效应的标定v 上样v 洗脱 操作要点：q 分步洗脱法 (stepwise elution)q 梯度洗脱法 (gradient elution)v 目的蛋白的鉴定与回收v 离子交换剂的再生与储存离子交换层析钻井液性能及其
16、测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件 原理：利用分子筛效应分离提纯具有生物活性的生物大分子物质二、凝胶过滤层析 (gel filtration chromatography) 凝胶的种类： v 琼脂糖凝胶 (Sepharose)v 交联葡聚糖凝胶 (Sephadex)v 聚丙烯酰胺基葡聚糖凝胶(Sephacryl)钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件钻井液性能及其测试组织损伤与修复实验分析课件组织行为学课件v 样品的准备 v 凝胶的选择与处理 v 装柱（L:W=50-100:1） v 柱填充的检测 v 上样（1%-5%)v 洗脱 v 目的蛋白的鉴定与回收 v 层析柱再生与储存 操作要点： 凝胶过滤层析的应用：v 脱盐v 蛋白质分离v 相对分
