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1、流式细胞术在白血病流式细胞术在白血病/ /淋巴瘤分型和监测中的应用淋巴瘤分型和监测中的应用2世界卫生组织血液肿瘤分类方案（1999年）“新分类方案的基本原则是：结合形态学、免疫表型、遗传改变和临床特征来鉴定疾病的真实本质”。“这为世界各国肿瘤学家和病理学家提供了一个全新的与令人兴奋的合作交流新篇章，必将极大促进人们对血液肿瘤的治疗与认识。”（美国临床肿瘤协会，临床肿瘤杂志 17卷3835-3849页，1999年）更重要的是提供了疾病分类与治疗选择和预后判断的较明确关联性，开启了血液肿瘤靶向性治疗和个性化方案的新时代。3白血病分子诊断的意义系统诊断白血病初发发异常标记精确诊诊断 准确预预后 指导
2、导治疗疗 科研资资料残留监监 测测 靶向治疗疗免疫/遗传遗传 学靶 标标MICM诊诊断4WHO血液肿瘤新分类实验技术平台实施WHO血液肿瘤新分类方案高 度依赖流式细胞、细胞遗传和分子生 物学实验技术平台以及掌握这类实验 技能并具有专业知识的人员。56Investigative Tools for MM diagnosis and Management (2008 ASH Education Program Book p298) Patient Evaluation诊断 单克隆蛋白数量和特征 血清蛋白电泳和免疫球蛋白定量 24小时尿蛋白；总蛋白；本周蛋白 尿和血清免疫固定 血清自由轻链和比例 骨
3、髓检查和骨髓活检Bone marrow aspiration and biopsy 组化 免疫分型-克隆检定，及通过CD38/CD56/CD19/CD45抗体组合能从90余例患者正常浆细胞中找到检测残留MM细胞 终末器官损害评价 全血细胞计数；生化检查: 血清肌酐和骨钙测定 预后评估 球蛋白，betta-2微球蛋白, LDH, CRP 骨髓细胞遗传学和FISH t(4;14), t(14;16), del 17p针对某些特定患者的特殊研究7传统流式细胞术的临床应用 细胞计数：CD4、CD34 DNA含量：多倍数、S期 结果是数据、准确性依赖于良好的质控 传统流式细胞术在白血病免疫表型中的应用
4、单参“白血病表型”，阳性比率大多数细胞为肿瘤细胞 多为形态学/细胞化学后的确认数据由临床医师判断高分辨流式细胞的优点 以多参数正常抗原表达为基础 结果类似病理报告 用于原发性诊断与鉴别诊 断 用于疾病分期，治疗选择疗 效监测 ，预后判断流式细胞术8骨髓-异质性系统中的应用多系列 Lymphocyte (T, B, NK) Monocyte Neutrophil Eosinophil Basophil Erythrocyte骨髓中各系列细胞处于连续性成熟阶段必须能涵盖所有细胞9应该使用何种抗体？所有抗体必须为标准的商业化试剂没有什么“秘密武器”或者专门特异的抗体抗体的联合应用能使你从有限的标本中
5、得到最大化的信息量对正常抗原表达的正确认识能帮助你有效地鉴别疾病状态相关的改变10高 分 辨 流 式 细 胞 术 能 够 鉴 别 和 分 类 所 有 骨 髓 细 胞可 以 对 每 一 个 细 胞 进 行 多 特 征 性 的 检 测 并 对 其 相 应 的 系 列 和 成 熟 的 阶 段 进 行 分 类 至 少 检 测 一 万 个 细 胞， 分 辨 率 达 到 0.5 %1112CD45/SSWood (2004) Methods Cell Biology 75:559-57613正常粒系成熟模式正常 B 系成熟Wood (2004) Methods Cell Biology 75:559-57
6、615表达交叉系列的抗原非同步抗原共表达：CD34与CD15、CD11b、CD56、CD14抗原的过度表达：早前B-ALL中CD10抗原表达缺失：泛T抗原易位抗原表达：CSF中TdT+淋巴细胞，骨髓中胸腺发育阶段的T淋巴细胞光散射异常：FSC和SSC白血病相关的免疫表型特点16AML-M017AML-M218AML-M319AML-M420AML-M521B-ALL22Burkitt淋巴瘤/白血病 成熟B-ALL23MAL T+G MAL T+B 24AUL25B-CLL/SLL26HCL27大B细胞淋巴瘤28MM29T-ALL30NK-LGL31报告包括 出现或缺乏的异常细胞群 异常免疫表型
7、 相比正常细胞群的抗原强度 增强，减弱，缺失 定量层面的判断 相对于全部CD45阳性细胞 (WBCs) 出现的其它细胞群3233TCRV克隆34小结流式细胞术有助于血液系统异常疾病的诊断 更加确定的诊断 排除其他疾病 有助于细分亚型 更准确的原始细胞辨别和定量 有助于预后判断 治疗后监测 快速35免疫表型分析与FAB分型基于不同的参数对白血病进行分型，两者的结果可一致或不一致；对有些病例，尤其是髓系白血病亚型，免疫表型分析并非特异；对于复杂的病例，需结合多种检查，如特异性染色体核型分析或融合基因综合判断。36MRDMRD背景背景目前由于多种化疗药的联合应用，使多数白血病患者可以获得形态学的完全
8、缓解（CR）。但多数患者不能维持长期缓解，仍有相当多的患者再次复发。复发的主要原因是患者体内存在少量的形态学难以辨认的残存白血病细胞。 如果能够准确检测患者体内残存的白血病状态，可以有的放矢地进行治疗，使患者避免许多不必要的痛苦。37MRDOutline of Leukemic DiagnosisMorphology: 1-5%, Cytogenetics: 1-5%,Flow cytometry: 0.1-0.01%,RT-PCR: 0.01-0.001%CRPrimary leukemi aOSChemoth erapiesAuto SCT Allo SCTInductionLeukemi
9、c cells100%1% 0.1% 0.01 0.001 3839Molecular Measurements of Treatment Response Clinical Application (2008 ASH Education Program Book p367)Application Action检测治疗早期的反应佳 加强治疗检测治疗早期的反应差 无需加强治疗 检测复发加强治疗，准备HSCTHSCT前MRD 评估 优化HSCT的时间HSCT后MRD评估 调整免疫抑制治疗时间，等临床试验结束时的MRD评估 评价新的抗ALL药物或治疗的结果40MRD与预后当残存白血病细胞10-2，3
10、年复发率为76-94%10-3 95 % 儿童ALL 90-95 % 成人 ALLAML 85% 儿童 AML 80-95% 成人 AML44报告模板45病例一 AML病例资料：女，3岁，2009.6 初发FCM印象：在CD45/SSC点图上设门分析，原始细胞分布区域可见异常细胞群体，约占有核细胞的26%，主要表达HLA-DR、CD13、CD15、CD33、CD34、CD38、CD117，（CD19+2.27%）。淋巴细胞比例降低。提示：急性髓系细胞白血病（AML-M2可能）。 基因：AML1/ETO 阳性。46病例一（续1）2009.7 化疗 D33：FCM：可见残留，CD33+CD19+细
11、胞约占0.04%。基因： AML1/ETO 阳性。472009.9 D70：FCM：未做。基因：AML1/ETO 阴性。2010.3 D245：FCM：未见免疫表型明显异常的细胞。基因：AML1/ETO 阴性。病例一（续2）48病例二 B-ALL病例资料：男，3岁，2007.3 初发FCM印象：在CD45/SSC点图上设门分析，CD45弱表达分布区域可见异常细胞群体，约占有核细胞的45%，表达HLA-DR、CD10、CD19、CD22、CD34、CD38、Gly-A、cCD79a、TdT。提示：急性B淋巴细胞白血病（普通型B-ALL）。 基因：BCR/ABL阴性。492008.11 化疗 第2
12、0个月：FCM：未见明显表型异常的残留白血病细胞。（未附图）基因：未做。2009.09 化疗 第30个月：FCM：可见残留，在CD45dim/-区域可见约1.87%的CD10+CD19+CD20-细胞和约1.55%的HLA-DR+CD19+CD34+细胞，考虑为残留白血病细胞。（见右图）基因：未做。 病例二（续1）50病例二（续2）2010.03 化疗+DC-CIK 第36个月：FCM印象：在CD45/SSC点图上设门分析， CD45阴性略向原始延伸的分布区域可见异常细胞群体，与有核红细胞无分界，共约占有核细胞的89%，主要表达HLA-DR、CD10、CD15、CD19、CD20、CD22、C
13、D34、CD38、cCD79a、TdT。提示：结合病史，考虑急性B淋巴细胞白血病（普通型B-ALL）复发。 基因：ALL基因筛查示TSL/ERG阳性，其余均阴性。 51病例三 T-ALL病例资料：女，3岁，2008.10 初发FCM印象：在CD45/SSC点图上设门分析，原始细胞分布区域可见异常细胞群体，约占有核细胞的59%，与淋巴细胞分界不清，表达HLA-DR、CD5、CD7、CD33、CD34、CD38、cCD3。提示：急性T淋巴细胞白血病 。 基因：E2A、MLL、TEL、BCR融合基因均阴性。52病例三 （续1）2009.05 化疗 第7个月：FCM印象：存在CD33+CD5+HLA-DR+（0.01%） 、CD34+cCD3+（0.11%） 、CD7+CD117+ （0.07%）等免疫表型明显异常的T淋巴细胞，考虑为残留白血病细胞。 基因：未做。
