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1、使用前删除此我爱浪漫樱花文档主页：http:/ 随机扩增 dna 的多态性(rapd-dna) 分型是近年来继质粒谱分析、脉冲场电泳、 探针杂交等分子生物学分型方法之后，发展 起来的又一基因分型技术，在建立后的短短 几年内，它已在医院感染菌株基因多态性分 析中，显示了巨大的优势。为此，我们对金 黄色葡萄球菌进行 rapd 基因分型，以探讨 其在医院感染研究中的意义。 一、材料与方法 1.菌株来源：1998 年 2 月1999 年 4 月住广州市三所综合性医院患者，分别取自 痰、血液、伤口分泌物、腹水等临床标本， 经分离鉴定确定为金黄色葡萄球菌，共 85 株。医院感染 72 株，社区感染 13
2、株。由 一个实验室统一鉴定到种。所有菌株-70 冰箱保存。 2.医院感染诊断标准：参照卫生部医政 司医院感染监控协调小组制定的诊断标准。 3.工具酶及主要试剂：蛋白酶 k、taq dna 聚合酶及 dntps 均购自上海生物试剂公 司。 4.dna 提取：500 l lb 液体培养基增菌，使用前删除此我爱浪漫樱花文档主页：http:/ 25 l 蛋白酶 k，10%sds10 l 37温 育 1 小时。酚、氯仿、异戊醇抽提，无水乙 醇沉淀，溶解于 50l 双蒸水中，低温保存。5.引物：5-atgtaagctcctggggattcac-3 由中国科学院上海生物工程有限公司合成。 6.聚合酶链反应(
3、pcr)条件：反应体积为 50 l，含引物 2.0 mml/l，4 种 dntp 各 125mml/l，镁离子浓度 3.5 mml/l，待测 模板 1 l，taq 聚合酶 1 u。pcr 反应条件：921 min，25 2 min，65 1 min，共 35 个循环，扩增产物在 70 mv 电压，2 h，2%的琼脂糖凝胶电泳，透射紫外仪下照 相观察。 二、结果 rapd 分型结果：可扩增出 18 带，共 分为 37 个基因型。3 株未分型。 三、讨论 应用随机引物 pcr 进行指纹图谱分析， 相同引物，反应控制的条件(如退火温度镁 离子浓度、模板浓度)不同，所得指纹图谱 亦不相同，进行 pcr
4、 循环时退火温度一般选使用前删除此我爱浪漫樱花文档主页：http:/ 2535，40以上时扩增效率逐渐 减弱，另外镁离子浓度对扩增也有影响，随 着镁离子浓度的增加，长的扩增带逐渐增多， 短的扩增带逐渐减少，一般认为镁离子浓度 在 3.54.5 mmol/l 时，长短片段均能得到 良好的扩增1，2 。与肖征等3报道 相比，我们选择了更低的退火温度及稳定的 镁离子浓度，以确保 rapd 的分辨率。该方 法具有常规 pcr 技术的快速、安全、简便、 灵敏的特点，而且其引物是通用的，不必预 先知道该物种的基因序列。在医院感染研究 部门中，应用相同的引物，可用于不同细菌 的快速流行病调查，尤其是暴发流行
5、的调查， 为及时控制感染争取了时间，所以，该技术 为医院感染分子流行病学研究提供了切实可 行的研究方法。 本研究分型结果提示，三所医院之间基 因型差别较大，且同一医院医院感染株与社 区感染株基因型完全不同。说明在同一医院 内菌株存在着流行趋势，a 医院社区感染株 基因型相近但不相同，可能与来就诊患者相 对集中在该社区有关。另外 b 医院与 c 医院使用前删除此我爱浪漫樱花文档主页：http:/ 均存在相同或相近，从地理位置上而言，这 两所医院距离相对较近(约 2 公里)，离 a 医 院均较远(10 公里)。进一步说明了菌株流行 趋势，不仅与是否为医院感染株有关，与地 理位置亦有关。国内学者贺学
6、英等4应 用脉冲场电泳分型对金黄色葡萄球菌的研究 认为医院感染株为小流行，社区感染株为散 发，与本文观点不完全相同。 从 1998 年 1 月初11 月底，a 医院神 经外科 13 例不同时期住院的患者不同部位 的分离株，分别有 6 株和 7 株分为两个基 因型，说明这些菌株是同源的，同一病区存 在着交叉感染，同一病区可有不同的基因型 流行，同一菌株可以长期流行。英国报道 5在一所医院的重症监护病房病区 6 个 月分离出 17 株耐甲氧苯西林金黄色葡萄球 菌，其中 1 株来自护理员的手，16 株来自 患者，16/1 7 株具有相同基因型，说明护理 员的手可能是造成传播的感染源。有文献报 道6呼
7、吸道及鼻腔携带往往是其重要的 感染源，通过健康工作人员手及空气传播造使用前删除此我爱浪漫樱花文档主页：http:/ 流行的主要原因。严格洗手、操作时戴口罩、 加强消毒隔离措施是控制金黄色葡萄球菌交 叉感染的根本措施。 参考文献 1 welsh jg, meclellang m. finger printing genomes using pcr with arbitrary primers. nucleic acid res, 1990,18：7213- 7238. 2 williams j, kubelik ar, livak kj, et al. dna polymorphisms amp
8、lified by arbitrary primers are useful as genetic markers. nucleic acid res, 1990,18：6531-6535. 3 肖征，吴坚，杨继勇，等.重复片段 引物聚合酶链反应应用于医院感染流行病学 研究.中华医学检验杂志，1999，22：232- 234. 4 贺学英，周惠平.pfge 方法在医院感 染病原学监测中的应用.中华医院感染学杂 志，1998，8：75-77. 5 tambic a, power eg, analysis of an outbreak of non-phage-typeable 使用前删除此我爱浪
9、漫樱花文档主页：http:/ staphylococcus aureus by using a randomly amplified polymorph dna assay. j clin microbiol, 1997,35：3092-3097. 6 pujol m, prna c, pallares r, et al. nosocomial staphylococcus aureus among nasal carriers of mrthcillon resistant and methcillin srscwptibic strains. an j med, 1996,100：509-513.
