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1、生物技术综合实验生物技术综合实验实验一、不同方法从干酵母中 提取谷胱甘肽的比较实验目的n掌握从干酵母中粗提谷胱甘肽的各种方法；n掌握还原型谷胱甘肽定量的方法。实验材料n试剂：活性干酵母粉，36乙酸溶液，2H2SO4 溶液，乙酸：乙醇（v/v=2:1)溶液5碘化钾溶液，0.0001mol/L碘酸钾溶液， 2%偏磷酸溶液，淀粉指示剂n仪器：低速离心机实验原理n谷胱甘肽的性质n从活性干酵母中提取谷胱甘肽的原理及评 价方法优劣的指标n提取的注意事项n工业上提取谷胱甘肽的流程谷胱甘肽的性质n性质n谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽， 半胱氨酸侧链基团上连有一个活泼的巯基决定了其有氧 化型（G
2、SSG）和还原型（GSH）两种形式。n谷胱甘肽的分子量为307.2，等电点为5.93，溶于水、 稀醇、有机酸、酯类，不溶于醇、醚、丙酮；在水溶液 中易被氧化，在pH3.07.0环境下较稳定。n谷胱甘肽广泛存在于动、植物和微生物体内，干酵母中 含有约1谷胱甘肽，是提取谷胱甘肽最常用的原料。n生理功能抗氧化、清除自由基、解毒（CO、重金属）等。原理n提取原理谷胱甘肽是小分子物质，且在水中的溶解度较大，故可选择一些温和 的方法从干酵母中提取谷胱甘肽。在细胞不完全破碎的条件下，只要细胞壁表面出现一些裂缝，谷胱甘 肽就可以扩散到溶剂中。n评价指标n还原态谷胱甘肽的提取率；n杂质（蛋白质、核酸等）释放量少
3、，便于后续进一步分离纯化；n简便易行、提取效率高、成本低。注意事项n提取温度要尽量低，但反复冻融谷胱甘肽易分解；n提取时间要尽量短，防止其被氧化；n谷胱甘肽在偏酸性的条件下易保持还原态；n适当的固液比，既保证尽量多的谷胱甘肽被溶出也保 证提取液中谷胱甘肽的浓度较高，便于后续的分离纯 化。n适当的搅拌速度，既保证适当的传质速度，便于谷胱 甘肽扩散到溶剂中，也保证工业生产中能耗适当。工业上提取谷胱甘肽的流程酵母高产酵母诱变剂：亚硝基胍 、紫外线热水抽提离心去残渣提取液调 pH7.0左右吸附层析法： 壳聚糖做吸附 剂pH4.5左右的磷 酸盐缓冲液洗脱浓缩脱色喷雾干燥成品实验步骤n热水提取法：1g 干
4、酵母，加15mL 热水，95度水浴10min，立即冷却，取 8mL离心（5000rpm，15min），取5mL上清液滴定，记录滴定体积。n冷冻研磨处理后有机酸搅拌提取：1g 干酵母，先在研钵中研细， 加入10mL蒸馏水混匀，20度冷冻呈半固体状，研磨5min，加入5mL36 乙酸，室温下搅拌提取15min，取8mL离心（5000rpm，15min），取5mL上 清液滴定，记录滴定体积。n酸热处理酸水搅拌提取：1g 干酵母，加入15mL 2 H2SO4，60度水 浴下搅拌抽提15min，立即冷却，取8mL离心（5000rpm，15min），取5mL 上清液滴定，记录滴定体积。n有机酸稀醇搅拌提取
5、： 1g 干酵母，加入15mL 乙酸乙醇混合液 （v:v=2:1），室温下搅拌抽提15min，取8mL离心（5000rpm，15min），取 5mL上清液滴定，记录滴定体积。 注：待滴定的谷胱甘肽提取液置4度冰箱保存，防止其被氧化。n氧化还原滴定法确定谷胱甘肽的含量KIO35KI6HPO3 3I26KPO33H2O碘酸根离子在酸性条件下具有氧化性，能与还原态的 谷胱甘肽（GSH）反应，当GSH全部反应完时，碘酸 根离子将碘化钾氧化为碘，碘使淀粉指示剂变蓝变蓝 色，即 为滴定终点。n操作吸取5mL上清液，5mL 2%偏磷酸溶液，1mL 5%碘 化钾溶液于250mL锥形瓶中，并滴入2滴淀粉指示剂， 用0.0001mol/L碘酸钾标准溶液滴定至终点。 注意事项：n在酸性溶液中，淀粉会缓慢水解，使滴定终点的颜色发生变化，故滴定操作要快速完成。实验结果处理方法热水提取 冷冻研磨 处理后 有机酸搅 拌提取酸热处理 酸水搅拌提 取有机酸 稀醇搅拌 提取滴定体积 （mL）思考题n比较本实验四种方法的优缺点。
