《生物技术实践》复习课件

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1、pp微生物的分离和培养微生物的分离和培养pp酶的研究与应用酶的研究与应用ppDNADNA和蛋白质技术和蛋白质技术生物技术与实践生物技术与实践一、微生物的培养与分离 微生物的培养与分离培养基的配制微生物的分离纯化大肠杆菌的操作 某种微生物数量的测定土壤中分解尿素细菌的分离与计数 培养基对微生物的选择作用分解纤维素的微生物的分离 利用微生物进行发酵来生产特定的产物u果酒、果醋、腐乳的制作 发酵过程中亚硝酸盐含量的测定u制作泡菜并检测亚硝酸盐含量 微生物的培养：1.培养基培养基的种类依据物理性质、化学成分、用途划分培养基的营养碳源、氮源、水、无机盐配制培养基的操作：倒平板与平板倒置u制备牛肉膏蛋白胨

2、固体培养基计算（配方比例）称量（各种成分）溶化（琼脂）调整pH灭菌倒平板2.灭菌与消毒方法及对象灭菌方法：灼烧、干热、高压蒸汽、过滤灭菌法灭菌对象：培养基、培养皿、接种用具等消毒方法：煮沸消毒、巴氏、酒精、过氧乙酸、紫外线消毒的对象：操作台、操作空间、操作者的衣着和双手3.接种纯化大肠杆菌的操作平板划线法平板划线操作五区划线法倒置培养皿 稀释涂布平板法 系列稀释操作涂布平板操作：4. 培养恒温培养箱u培养：放在培养箱中，适宜恒 温、氧气、二氧化碳的含量 5. 观察菌落：u菌落群体结构特征：菌落的形状、大小、边缘、光泽 度、隆起度、透明度等u是菌种鉴定重要依据u菌落的观察二、某种微生物数量的测定

3、：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1. 选择菌种 2. 梯度稀释培养菌液 3. 稀释涂布接种4.统计菌落数目：p样品稀释度足够高时，一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌（不是绝对的）。p实验至少要涂布三个平板作为重复组p一般选择菌落数在30300的平板计数p每克样品中的菌落数p平均菌落数稀释液的体积稀释的倍数稀释涂布平板法鉴别培养基固体选择培养基液体三、培养基对微生物的选择作用分解纤维素微生物的分离四、利用微生物进行发酵来生产特定的产物果酒和果醋的制作果酒果醋实验原理酵母菌无氧分解葡萄糖产 生酒精醋酸杆菌有氧分解葡萄 糖、乙醇产生醋酸实验设计 操作过程挑选葡萄冲洗榨汁酒精发酵醋酸发酵无氧1-

4、3周 有氧10天左右生成果酒 生成果醋结果评价 成分鉴定3mol/LH2SO4 3滴、饱和 重铬酸钾溶液3滴，酒精与 重铬酸钾反应呈现灰绿色 或通过嗅味和品尝观察菌膜、嗅味、品尝， 检测和比较醋酸发酵前后 的pH、显微镜观察。腐乳的制作腐乳的制作腐乳的制作腐乳的制作.实验原理用豆腐由多种微生物（用豆腐由多种微生物（主要毛霉主要毛霉）参与）参与 发酵制成发酵制成毛霉等微生物产生的以蛋白酶为主各种毛霉等微生物产生的以蛋白酶为主各种 酶酶发酵的最佳温度为发酵的最佳温度为151518 18 。 2. 操作条件酒精含量的控制：酒精含量的控制：盐的浓度控制盐的浓度控制: :水分保持在水分保持在70%70%

5、以下以下3.实验设计及操作. 课题成果评价是否完成腐乳的制作腐乳质量的评价影响腐乳质量的因素： 菌种和杂菌：菌种和杂菌：杂菌污染则直接影响产品的色、香、味。杂菌污染则直接影响产品的色、香、味。 温度：温度：温度影响菌丝的生长和代谢温度影响菌丝的生长和代谢 发酵时间：发酵时间：发酵时间影响生化反应度及生化产物的量发酵时间影响生化反应度及生化产物的量 调味品：调味品：各种酒类、糖类等辅料的多少也对口感有重要影响各种酒类、糖类等辅料的多少也对口感有重要影响五、泡菜中亚硝酸盐五、泡菜中亚硝酸盐 含量的测定含量的测定1. 实验原理：乳酸菌无氧条件将葡萄糖分解成乳酸。泡菜 中微生物将蔬菜中硝酸盐还原成亚硝

6、酸盐， 亚硝酸盐在特定的条件下会转变成致癌物 亚硝胺。用对氨基苯磺酸重氮法测量亚硝酸盐含量（ 紫红色）：在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨 基苯磺酸形成重氮化合物，再与N-1-萘基乙 二胺偶合，形成紫红色染料与标准显色液比 较、定量分析。 2. 操作步骤腌制泡菜制备标准显色液制备样品处理液比色结果分析计算、亚硝酸盐含量的测定制备样液制备样液制备样液制备样液显色显色显色显色 处理处理处理处理标标标标 准准准准 比比比比 色色色色泡菜亚硝酸盐含量（mg/kg）= 样品亚硝酸盐含量 取样量（40ml滤液）比色亚硝酸含量单位：1g= 10-3mg取样量：0.41/260/50040/100 = 9.610-

7、3kgp观察样品颜色的变化，并与标准显色液比较，找出与标准液最相近的颜色，记录对应的亚硝酸钠含量，并计算。每隔2天测一次，将结果记录下来。4.实验结果分析1号坛2号坛3号坛 1月4日0.150.150.15 1月8日0.600.200.80 1月12日0.200.100.60 1月15日0.100.050.20 1月19日0.100.05020果酒、果醋、腐乳、泡菜相关内容比较比较果酒果醋腐乳泡菜微生物酵母菌醋酸杆菌毛霉菌乳酸菌生物类型真核原核真核原核呼吸类型兼性厌氧 酒精需氧醋酸需氧菌丝层厌氧乳酸生殖类型出芽生殖分裂生殖孢子生殖分裂生殖原理无氧分解 葡萄糖产 生酒精。有氧分解 葡萄糖、 乙醇

8、产生 醋酸。毛霉分解蛋 白质和脂肪 ，配料腌制 生成腐乳香 气。乳酸菌无 氧分解葡 萄糖产生 乳酸。果酒、果醋、腐乳、泡菜相关内容比较比较果酒果醋腐乳泡菜微生物生物类型呼吸类型生殖类型原理微生物的培养与分离主要考查内容培养基的类型与配制液体、固体、选择、鉴别倒平板、平板倒置灭菌与消毒灭菌与消毒的方法与对象接种方法平板划线法、稀释涂布平板法微生物的培养温度、pH、含氧量、培养箱、天数观察结果菌落形态、菌落周围透明圈、抑菌圈等二、酶的研究与应用果胶酶在果汁生产中的作用探讨加酶洗衣粉的洗涤效果酵母细胞的固定化果胶酶果胶酶在在果汁果汁生产生产中的作用中的作用1.实验原理：果胶是植物细胞壁的主要成分，果

9、胶酶 和果胶甲酯酶可水解果胶，与制取果汁 有关果胶酶适宜温度范围：10-50 适宜 pH值为3.2-5.0相同重量的苹果泥在不同温度或pH值下 和相同时间内比较果汁产量，从而确定 果胶酶的最适反应温度或 pH值2. 实验设计操作步骤：设置不以温度或pH梯度探究最适温度或pH值.观察并记录数据4.结果分析与评价曲线图形式表示不同温度或不同pH下，制作1L果汁与果胶酶用量的关系，分解果汁的最适温度和pH。如何判断果胶是否被全部分解果胶不溶于酒精（混浊）探讨加酶洗衣探讨加酶洗衣粉的洗涤效果粉的洗涤效果. 原理：利用添加了蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维 素酶等酶类的洗衣粉，将蛋白质、油脂、淀 粉、纤维素

10、等类污渍水解成水溶性小分子物 质。 2. 实验目的：探究在什么温度下使用加酶洗衣粉的洗 涤效果最好探究普通洗衣粉和加酶洗衣粉对衣物污 渍的洗涤效果探究添加不同种类酶的洗衣粉其洗涤效 果有哪些区别.实验设计 .结果分析与评价确定加酶洗衣粉的洗涤效果最好的最适温度比较普通洗衣粉和加酶洗衣粉洗涤效果分析各种不同品牌的加酶洗衣粉对油渍、汗渍、血渍的洗涤效果酵母细胞的固定化酵母细胞的固定化酵母细胞的固定化酵母细胞的固定化1. 实验原理：酶在催化反应中易变性失活，反应后不易回收再利用，提高成本，影响产品质量。将酶固定在不溶于水的载体上，既能与反应物接触，又能与产物分离，可回收反复利用。酶是由细胞合成的，直

11、接固定合成酶的细胞，既操作简便，又可降低成本。. 固定化细胞技术固定化酶：是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体的说，指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测本实验有吸附法将淀粉酶的固定在石英砂上。用淀粉指示剂溶液测试，流出物呈红色，表明水解产物糊精生成。三、DNA和蛋白质技术DNA的粗提取与鉴定多聚酶链式反应扩增DNA段 PCR体外扩增DNA技术血红蛋白的提取和分离 DNADNA的的粗提取与鉴定粗提取与鉴定1.实验原理：NaCl溶液浓度为0.14mol/L时，DNA溶解度最低析出DNA；DNA不溶于酒精提纯DNA

12、；DNA遇二苯胺(沸水浴)能被染成蓝色鉴定DNA. 实验设计：制备鸡血细胞液柠檬酸钠提取血细胞的核物质蒸馏水溶解DNA2mol/LNaCl溶液析出DNA0.14mol/LNaCl溶液提纯DNA95冷酒精再溶解DNA2mol/LNaCl鉴定DNA二苯胺鉴定3. 实验设计实验材料的选择动物：鸡血（不能选择哺乳动物的红细胞 ）植物：菜花（用植物细胞作实验材料时 需要先用洗涤剂溶解细胞 膜）提取DNA的基本思路：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理 和化学性质方面的差异，提取DNA，去除 其他成分 提纯DNA：95冷酒精滤液静置min 出现白色丝状物鉴定DNA 2mol/LnaCl溶液mL白色丝状

13、的物 mL二苯胺溶液沸水浴min出现蓝 色反应设置对照 2mol/LnaCl溶液mLmL二苯胺溶液 沸水浴min没有蓝色反应观察实验结果： 实验组与对照组是否变蓝（PCR体外扩增DNA技术） 多聚酶链式反应 多聚酶链式反应扩增扩增DNADNA片段片段1. 实验原理：通过温度变化控制DNA的变性和复性 ，可将极微量的靶DNA特异地扩增上 百万倍通过设计相应的引物，加入四种脱氧 核苷酸原料、DNA模板、TaqDNA聚合 酶(耐高93高温)等，完成特定基因 的体外复制。OOPOHO碱基OOHOOPOHOOH碱基5335碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖磷酸基团磷酸基团碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖碱基碱基脱氧核糖脱

14、氧核糖53脱氧核苷酸链间的连接dNTP四种脱氧核苷酸(dNTP).实验操作第一步第一步第一步第一步第二步第二步第二步第二步第三步第三步第三步第三步靶序列（目的基因）靶靶序列（目的基因）序列（目的基因）PCR 循环第一步 ：加热变性靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物 引物引物 5 5 3 3 5 5 5 5 3 3 5 5 3 3 3 3 PCR 循环第二步 ：引物与靶序列退火靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物引物引物5 5 3 3 5 5 5 5 3 3 5 5 3 3 3 3 TaqTaq DNA DNA 聚合酶聚合酶PCR 循环第三步 ：引物延伸靶序列靶序列靶序列靶序列第1个 PCR 循环完成

15、后 ：得到两 个拷贝的靶序列循循环环 次数次数DNADNA数量数量1 12 2 2 24 4 3 38 820201,048,5761,048,57630301,073,741,8241,073,741,824上述三个步骤大约需要重复1530次 循环，循环后靶序列扩增的数量为n. 结果分析与评价理论上理论上DNADNA扩增数目的计算扩增数目的计算 一条一条DNADNA，复制，复制n n次，次， DNADNA为为2 2 n n a a条条DNADNA，复制，复制n n次，次， DNADNA为为a x2 a x2 n n测定DNA扩增的倍数PCR仪加热至93使模板DNA变性降温至55复性使引物与模板DNA碱基互补再升温至72J时，DNA沿着35复制延伸在Taq聚合酶作用下进行以四种脱氧核苷酸(dNTP)（N=ATCG）为原料,以引物为复制的起点,合成新链。子链沿53方向聚合重复改变反应温度,经变性、复性和延伸三个阶段为一个循环,一般样品是经过30次循环, 使基因放大了数百万倍;