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1、第四节 代谢调节控制育种代谢调节控制育种是通过特定突变型的选 育，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产 物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜 的透性，使代谢流向目的产物积累方向进行 。外因控制培养调节内因控制突变体调节调节 体系育种措施诱导诱导 分解阻遏 分解抑制1组组成型突变变株的选选育 2抗分解调节调节 突变变株的选选育解除碳、氮、磷源分解调节调节 突变变株反馈馈阻遏 反馈馈抑制营营养缺陷突变变株 渗漏缺陷突变变株 回复突变变株 耐自身代谢产谢产 物突变变株 抗终产终产 物结结构类类似物 耐前体物突变变株 条件突变变株细细胞膜渗透性营营养缺陷突变变株 生物素、油酸、甘油缺陷型 温敏突变变株
2、一、组成型突变株的选育组成型突变株是指操纵基因或调节基因 突变引起酶合成诱导机制失灵，菌株不经 诱导也能合成酶、或不受终产物阻遏的调 节突变型。这两种突变株在工业上都可能得到应 用，特别是在微生物酶制剂工业上。Regulatory generepressorNOoperatorrepressorNOoperator筛选方法1、限量诱导物法 诱变恒化器 低乳糖浓 度突变株不需诱导物也能合成 - 半乳糖 苷酶，把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖作为 能源和代谢原料，而迅速生长。野生型菌株因缺少诱导物和相应的诱导 酶，不能利用乳糖而淘汰。 2、循环培养法 诱变 不含诱 导物 不含诱 导物 含诱导物 含诱导物
3、 3、鉴别性培养基的应用诱变后的 孢子 以甘油为唯一碳源 涂布 向菌落上喷射 O-硝基苯酚- -D-半乳糖苷 组成型 突变株诱导型原理 ： 组成型菌株在没有诱导物的作用下 仍能合成 半乳糖苷酶，将无色试剂水解 ，放出 O硝基苯酚。4、筛选将处理后的菌体移接到含有诱导能 力低，但能作为良好碳源的诱导物的 培养基中培养，突变体能良好生长， 野生型不能生长。例：-半乳糖苷酶组组成突变变株的筛选筛选底物采用苯- -半乳糖二、抗分解调节突变株的选育 抗分解调节突变株：指抗分解阻遏和分解抑 制的突变 （一）解除碳源调节突变株的选育 （二）解除氮源分解调节突变株的选育 （三）解除磷酸盐调节突变株的选育选育有
4、关抗分解调节的突变株，其实就 是筛选合成酶产生不受碳、氮、磷的代谢阻 遏或抑制的突变株，使抗生素提前到菌体生 长期开始合成，从而延长了产抗期而提高产 量。（一）解除碳源调节突变株的选育n 在次级代谢中，高浓度的葡萄糖对青霉素 转酰酶、链霉素转咪基酶和放线菌色素合成 酶等抗生素的关键酶均有分解阻遏作用。n 在实际生产中，采用流加葡萄糖或应用混 合碳源可以控制中间代谢产物的积累，来减 少不利影响。n 根本的解决办法是筛选抗碳源分解调节突 变株。筛选方法： 1、循环培养法2、鉴别培养基喷ONPG，抗分解阻遏的菌落呈黄色，野 生 型是白色。 3、特殊氮源 组氨酸酶突变株葡萄糖+组氨酸分解代谢抑制物+唯
5、一必须被分解的氮源 O-硝基苯 酚-D-半 乳糖苷（一）解除碳源调节突变株的选育葡萄糖 乳糖突变株 野生株有半乳糖酶n4、葡萄糖结构类似物CH2OHCHO OHOH OHHHHHHOCH2OHCHO HOH OHHHHHHOCHO OHOOH OHHHHHH3C-OCH2OH葡萄糖2-脱氧葡萄糖3O甲基 葡萄糖特 性： 1、结构与葡萄糖类似。2、不被微生物代谢， 也不阻抑微 生物生长。3、和葡萄糖 一样 会阻遏诱导酶的 合成，其 阻遏作用 甚至比葡萄糖还要强。 n筛选方法 ： 不 含 阻 遏 物涂布 诱变 后的 菌株培养基含有氮源、无机盐、生 长因子、低浓度的2dG或3 mG及一种生长碳源 ，
6、该碳源 需诱导酶才能利用验证含阻遏物比 较n例如： 桔林油脂酵母合成淀粉酶：玉米淀粉 、酵母膏、蛋白胨及含有0.01%2dG的琼脂 平板。n木霉合成 纤维素酶：含酸膨胀纤维素 、蛋 白胨、无机盐、胆汁 、防菌扩展剂、2-dG 的琼脂平板。抗性突变株的性质n在2-dG或3-mG平板上生长的菌落接入斜面 ，对它们在含阻遏物和不含阻遏物培养基中 的产酶能力比较，结果表明，大部分变株是 抗分解阻遏突变型，并发现它们在去除阻遏 物的培养基中酶活力往往高于野生型菌株。含葡萄糖不含 葡萄糖含淀粉（二）解除氮源分解调节突变株的 选育n次级代谢的氮降解物的阻遏主要指铵盐和其 他快速利用的氮源对抗生素生物合成具有
7、分 解调节作用。n筛选芽孢杆菌中耐氨基酸菌株，是提高蛋白 酶产量的一种有效方法。因为高浓度氨基酸 会抑制芽孢的形成，并且阻遏蛋白酶的合成 。 氨基酸1.5mg/ml水解蛋白10mg/ml（三）磷酸盐对次级代谢的调节机制 1.通过初级代谢的变化影响次级代谢 加强初级代谢，推迟抗生素合成的 起始。 磷酸盐是许多初级代谢反应酶 的效应物。 2.改变糖类分解代谢途径：磷酸盐有利于糖酵解，从而降低了 戊糖途径的活力，导致以戊糖途径为先 导的抗生素合成受抑制。例如：四环素、金霉素、土霉素、竹 桃霉素3.限制抗生素合成的诱导物甲硫氨酸是头孢霉素和磷霉素的诱导物色氨酸是麦角碱的诱导物，而磷酸盐是色氨 酸合成酶
8、等的抑制剂； 4.抑制或阻遏磷酸酯酶类的合成链霉素、紫霉素、新霉素等生物合成中某些 中间代谢产物需经磷酸化，因此从中间产物到 终产物需由磷酸酯酶类， 而磷酸盐抑制或阻遏 磷酸酯酶的合成。例如磷酸盐明显抑制链霉素的生物合成通过 抑制形成链霉胍的三步 磷酸盐分解反应。n磷酸盐对ATP调节：cAMP ATPn例如：灰色链霉菌静息细胞研究磷酸 盐对杀假丝菌素合成的影响。当加入 10mol/L磷酸盐后，5minATP增加5 倍，15min抗生素合成受抑制。n发酵中磷酸盐浓度控制在亚适量水平 。解除（抗）磷酸盐调节突变株的选育底部加浸润250mm/L 磷酸盐的滤纸灰色链霉菌诱变后涂布于琼脂平 板含10mo
9、l/LNa3PO4不含Na3PO4脱敏感 突变敏感菌三、营养缺陷型在代谢调节育种中 的应用n生物遗传学上：阐述代谢途径n工业微生物代谢控制育种上：筛 选到解除反馈的菌株。（一）在初级代谢调节育种的应用阻断代谢流或切断支路代谢，使代谢途 径朝着有益产物合成方向进行。还可以通过营养缺陷型解除协同反馈效 应，降低终产物的数量，以累积支路代 谢中某一末端产物。1、在直线式生物合成途径中谷氨酸 N-乙酰谷氨酸 N-乙酰-谷氨酸磷酸N-乙酰谷氨酸半醛 N-乙酰鸟氨酸鸟氨酸 瓜氨酸 精氨酰琥珀酸精氨酸利用氨基酸缺陷型 突变株进行鸟氨酸 发酵2、在分支生物合成途径中葡萄糖 乙酰辅酶A柠檬酸酮戊二酸谷氨酸硫胺素
10、生物素脂肪酸谷氨酸棒杆菌营养缺陷型产生L谷氨酸的生物 合成途径5-磷酸核糖焦磷酸次黄嘌呤核苷酸琥珀酸腺核苷酸腺核苷酸黄嘌呤核苷酸鸟核苷酸酶缺失例： 谷氨酸棒杆菌的腺核苷酸、鸟核苷酸合成代 谢途径协 同 反 馈天冬氨酸天冬氨酸半醛高丝氨酸苏氨酸天冬酰胺赖氨酸 高丝氨酸营养缺陷型菌株赖氨酸的合成 途径高丝氨酸 脱氢酶协同反馈抑制DES同工酶（二）在次级代谢育种中的应用丙二酰CoA灰黄霉素 四环素 制霉菌素脂肪酸 抗生素产量受脂肪酸代谢途径 的影响脂肪酸缺陷型n氯霉素产生菌初级代谢途径中的色氨 酸、酪氨酸、苯丙氨酸中的任何一个 氨基酸发生营养缺陷突变，都会使氯 霉素产量增加。n营养缺陷菌株还可以产生
11、新品种。金霉素第六个碳原子是由蛋氨酸供 应，若获得蛋氨酸缺陷型，结果产生 去甲基金霉素。四环素合成中，甲基化酶缺失，便 形成了去甲基四环素。例2赤藓糖4磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸预苯酸 L-苏对氨基 苯丝氨酸DAPH分支酸L-对氨基 苯丙氨酸氯霉素酪氨酸邻氨基苯甲 酸色氨酸 PABA 杀假丝 菌素 苯丙氨酸其它例子见p235四、渗漏缺陷型在代谢调节育种的 应用n渗漏缺陷型：遗传代谢障碍不完全的突变型n特点：酶活力下降，但不完全丧失，能在基 本培养基上少量生长。n筛选方法：营养缺陷型菌株 基本培养基天冬氨酸天冬氨酸半醛高丝氨酸苏氨酸天冬酰胺赖氨酸 高丝氨酸营养缺陷型菌株赖氨酸的合成 途径高丝氨
12、酸 脱氢酶协同反馈抑制高丝氨酸 脱氢酶活 力下降， 没有完全 丧失五、抗反馈调节突变株的选育抗反馈调节突变株是一种解除合成代 谢反馈调节机制的突变型菌株。其特点是所需产物不断积累，不会因 其浓度超量而终止生产。n “抗反馈抑制突变型”n “抗阻遏突变型”Structure geneproductEnzyme 调节中心NORegulatory geneproteinproductNOoperator在实际应用中，解除反抗调节可由 以下方面：从遗传上解除反馈调节 各 种抗性和耐性育种，回复突变子的应用截流或减少终产物堆积 借 助营养缺陷型或采用渗漏缺陷型移去产物 借 助膜透性突变抗反馈调节突变株获
13、得途径（一）回复突变引起的抗反馈调节突变株 （二）耐自身产物突变株选育 （三）抗终产物结构类似物突变株的选育 （四）累积前体和耐前体突变株的选育（一）回复突变引起抗反馈调节突变株正向突变：微生物从野生型经自然突变或人工 诱变突变成有益突变型。 回复突变：当具有突变型基因的个体通过再突 变又变成野生型表型。噬菌体敏感野生型噬菌体抗性突变株噬菌体敏感野生型表型 前后表型同，但实质有区别1、回复突变的原因（1）原有基因的回复突变 （2）非原有基因的回复突变原有基因位点 消除A基因C基因B基因ACBACB原有基因不同 位点不同基因不同 位点基因内抑制突变真正回复突变抑制基因突变n 区别基因回复突变和抑
14、制基因突变，可 以将回复突变菌株和野生菌株进行回交试验 或杂交重组试验来观察它们的子代是否有突 变型出现：n 杂交结果有同样的突变型重新出现，说 明回复突变和原来突变型不在同一座位上而 是分开的，属于抑制回复突变。反之，如果 杂交后代没有产生突变型，表明回复突变的 座位与原突变型基因位点相同，是真正的回 复突变。回复突变的测定n回复突变常发生在遗传物质没有明显获得或 缺失的点突变。苏氨酸营 养缺陷型基本培养基抗链霉素细菌的回复突变n依赖性突变株：抗链霉素突变株中有少数必 须在有链霉素存在的时候才能生长。诱变后 的菌株含链霉素 含链霉素不含链霉素含链霉素不含链霉素依赖性突变株2、回复突变引起的抗
15、反馈调节突变株的 筛选（1）初级代谢途径障碍性回复突变型原养型营缺型原养型诱变诱变酶活力恢复，但调节中心已发生改变， 不能与阻遏物结合，因此解除了反馈调节机制5-磷酸核糖焦磷酸次黄嘌呤核苷酸琥珀酸腺核苷酸腺核苷酸酶活力恢复， 调节中心改变鸟核苷酸酶缺失例： 黄嘌呤核苷酸（2）次级代谢途径障碍性回复突变n抗生素回复突变株n零变株：完全丧失产生抗生素的能力，但 回复突变株的产量往往比亲株高。原养型营缺型原养型诱变诱变原养型零变株原养型诱变诱变例如金霉素、链霉素一个共同的趋势：发生障碍性突变的营养缺 陷型，抗生素产量都比亲株抵，而回复突变株往 往比原养型亲株高。营养缺陷型菌株中，几种不能合成的 氨基
16、酸与抗生素合成有关。基因突变的结 果，使菌体丧失了合成这些氨基酸的某种 酶的活力，导致抗生素产量 下降。而回复突变导致合成氨基酸的酶的调节 中心变化，氨基酸能大量合成。抗生素大量合成。分析原因分析原因氨基酸抗生素甲硫氨酸金霉素亮氨酸缬氨酸放线菌素（二）耐自身产物突变株选育自身产物：初级代谢产物次级代谢产物n大多数抗生素都受本身的反馈调节，特别 是氨基糖苷类抗生素。n提高耐受性就意味着提高抗生素的产量。n选育对抗生素不敏感、钝化酶活性高的菌 株。n筛选：涂布于含自身抗生素的平板上，逐 级提高抗生素的浓度。从土壤中筛选Aurdox20-40mg/L改良培养基和培养条件500mg/L紫外线诱变，零突变0mg/L紫外线诱变，回复突变600mg/L耐自身抗生素1.6-2.5g/L除耐受自身产物之外，还可以考虑与以下
