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1、六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习需要克隆的需要克隆的DNADNA片段片段编码某种蛋白质编码某种蛋白质研究某基因结构和功能的关系研究某基因结构和功能的关系研究某基因与疾病的关系研究某基因与疾病的关系n n目的基因目的基因已被或准备要被分离、改造、扩增或表达的特定已被或准备要被分离、改造、扩增或表达的特定 基因或基因或DNADNA片段片段第三节第三节 目的基因的获取和表达目的基因的获取和表达六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理
2、论的主要内容课件八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习一、目的基因获取直接分离直接分离化学合成法化学合成法酶促合成法酶促合成法鸟枪法鸟枪法 ( (构建基因文库构建基因文库) )PCR PCR法法人工合成人工合成从生物基因从生物基因 组中分离组中分离六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习 化学合成n必须先知道目的基因核苷酸序列可由多肽链氨基酸序列反推DNA碱基序列六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件
3、八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习根据已知的DNA序列，通过化学合成的方法合成目的基因。单体一个个接上去，每接 一个单体就是一个循环反应。DNA合成仪是根据固相亚磷酸三酯法原理设计的。 六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习脱三苯脱三苯甲基甲基偶联偶联N N（iPriPr）2 2封端封端氧化氧化Hn n脱保护作用脱保护作用n n耦联反应耦联反应n n封端氧化反应封端氧化反应寡核 苷酸 合成 步骤六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学
4、高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习化学合成寡核苷酸限于200bp以下，需要将合成的寡核苷酸片段拼接成完整的基因。2.全基因合成策略六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习酶促合成法n先得到目的基因的mRNA，以mRNA为模板，在 反转录酶的作用下合成互补DNA单链，再在DNA 聚合酶I的作用下合成双链DNA分子六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一建军节主
5、题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习直接分离n提取总DNAn氯化铯梯度离心非洲爪蛙rDNA的分离 海胆rDNA的分离依赖于DNA密度差异，局限性大六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习 鸟枪法n基因文库n鸟枪法步骤n基因文库的构建过程n基因文库的特点n鸟枪法克隆目的基因的局限性又称散弹射击法或构建基因文库法，特别适合原核 基因的分离六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防
6、改革强军梦学习从特定生物个体中分离的全部基因 ，通过人工构建将基因插入到载体上， 转化到受体细胞中，含有插入基因的重 组子的总和即为基因文库。基因以克隆 的形式存在。基因文库基因文库（gene library )六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习1）供体细胞中提取基因组DNA； 3）将这些片段分别载入运载体；2）用限制酶或超声波将供体细胞中的DNA切成许多片段；鸟枪法步骤六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八
7、一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习6）从中找出含有目的基因的克隆，再利用一定的方法将包含的基因的DNA片段分离出来。5）在培养基上生长繁殖成重组菌落或噬菌斑，即克隆。4）然后通过运载体转入受体细胞；六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习鸟枪法六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习1 1）基因组）基因组DNADNA的制备的制备基因文库的构建过程基
8、因文库的构建过程为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性， 用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度断裂。制备DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完整性也就越高。六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在100 kb左右。如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000 kb大小的DNA片段。六年级数学上册课件-比的基本性质
9、和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习2 2）基因组）基因组DNADNA的切割的切割基因组DNA片段的切割一般采用限制性内切酶部分酶切或超声波处理，随机片段化的方法。六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习部分酶切法一般选用四碱基识别序列的限制性内切酶，如：Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控。n 双酶切部分消化两种酶（Hae、Alu），片段10-30kb。缺点：都为平末端n
10、单酶切部分消化Sau3AI或MboI（同裂酶），粘末端，可插入 BamHI切的噬菌体载体中。六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的-DNA或柯斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体。4 4）载体和受体的选择）载体和受体的选择电泳或密度梯度离心，回收大小合适电泳或密度梯度离心，回收大小合适 的的DNADNA片段，与载体连接。片段，与载体连接。3 3）基因组）基因组DNADNA的回收的回收六
11、年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习上述几种载体的最大装载量如下：质粒 15 kb -DNA 25 kb柯斯质粒 45 kbBAC 300 kbYAC 400 kb用于基因文库构建的受体则根据载体使用大 肠杆菌或酵母菌。六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习n部分基因序列已知，用已知序列做探针 ，筛选文库。n部分氨基酸序列已知，推导出DNA序列 ，筛选文库。n根
12、据测序序列，设计引物进行扩增5）克隆基因的分离 六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习鸟枪法克隆目的基因的局限性n工作量较大，需要了解目的基因的背景知识n不能获得的最小长度的目的基因n不能除去真核生物目的基因的内含子结构六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一
13、建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习 PCR法PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序。 Kary Mullis1993 Nobel Prize in Chemistry 六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习 原理:六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习
14、总体积：一般为25l 或 50 l1）buffer3）底物（dNTPs）4）Taq酶5）模板6）引物常规常规PCRPCR反应的成分和作用反应的成分和作用六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习10 Buffer 4 l10mmol/L dNTPs 0.5 l P1(10mol/L) 1 l P2(10mol/L) 1 lTaq DNA Polymerase (5U/l) 0.2 lTemplate 10-100ng加ddH2O至 25lPCR反应体系六年级数学上册课件-比的基本性
15、质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习PCR反应程序94 4min， 1个循环； 94 30s50-60 30s 35个循环；72 30s72 10min， 1个循环；4保存、琼脂糖凝胶电泳六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习 二、DNA重组与表达n基因重组n目的基因与载体的连接六年级数学上册课件-比的基本性质和化简比江苏省连云港市田家炳中学高一生物现代生物进化理论的主要内容课件八一建军节主题教育活动PPT模板军队国防改革强军梦学习 DNA重组的类型位点特异性重组 （site-specific recombination ）接合(conjugation) 转化(tranformation) 转导(transduction)同源重组（homologous recombination ）转座
