激光共聚焦显微镜技术

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1、生物医学常用研究技术生物医学常用研究技术课程简介课程简介研究方法的重要性l现代科学研究以实证为基础l认识了解研究对象的工具l揭示研究对象变化和相互关系的手段l每项新的实验技术都蕴涵尖端的科学理论和学术进步l诺贝尔奖很大一部分授予了分析技术重大贡献者。l重视和熟悉实验技术是科研工作必备的条件。l熟悉实验仪器和技术将促使做出创造性的工作l“动口不动手”的“君子”是不可能在科学上做出重大成 绩的。生物医学常用研究方法形态观察分析方法l显微观察技术：光学显微镜（正置，倒置，体视，荧光，偏光，金相，激光共聚焦）， 电子显微镜（TEM， SEM，ESEM），扫描探针显微镜（SPM），显微X断层扫描仪（-C

2、T）等l形态测量与分析：各种分析测量软件物理性质分析方法l硬度分析l颗度分析l机械性能测定与分析l色彩分析化学性质分析方法l元素分析l基团分析l晶体分析l分子结构测量l电位测量分子生物学方法 l组织匀浆制备lDNA分离与提取lPCR技术l分子杂交与质粒构建l双向电泳技术lDNA，蛋白质测序细胞生物学方法l细胞培养与观察l流式细胞技术l显微注射技术l细胞活力分析微生物学方法l普通与厌氧培养技术l微生物鉴定技术l染色技术l菌落计数仪l螺旋接种仪l微生物自动鉴定仪样本制备方法l样本固定l脱水、包埋l组织切片技术l染色技术l其它目的通过讲课和见习，希望能达到以下目的：l 了解主要的生物医学常用研究方法

3、l 了解各种研究方法的原理和使用目的l 能根据研究目标选择正确的研究方法重要性掌握常用生物医学常用研究方法与技术，对在今后科学研究工作中作出高水平的创造性成果将会起到重要的作用。激光扫描共聚焦显微镜技术激光扫描共聚焦显微镜技术口腔疾病研究国家重点实验室口腔疾病研究国家重点实验室观察目标尺寸分辨率电子显微镜的缺点l由于样品需要固定,观测活细 胞十分困难.l样品制备过程（固定、包埋、 切片）造成的假象l只能观察标本超微形态和结构 ,无法对生理活动进行观察荧光显微镜的缺点l无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现 多荧光的同时采集l荧光散射光太强，造成实际分辨率大大下降。l荧光漂白很快，使荧光图像

4、的拍照有困难。l无法对样品进行断层扫描,完成3维重建工作.l对于信号较弱的样本,无法提高观察的灵敏度.l可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高 度重叠激光光谱Red:HeNe 633nm，Orange:HeNe 594nm，Green: HeNe 543nm，Blue: Ar 458nm; 476nm; 488nm 496nm, 514nm，Purple: Diode: 405 nm伪彩色的概念共聚焦显微镜的原理 光学原理SampleLaserPrismPMTAOBSFluorescent Microscope Arc LampEmission FilterExcitation Diaphr

5、agmOcularExcitation FilterObjectiveLaserPinholeExcitation PinholePMTExcitation FilterConfocal Microscope扫描成像原理三维重建原理棱镜分光技术光谱扫描技术l适用于所有染料，发射光谱位置及宽度可任意 调节l适合对自发荧光进行检测l最大程度降低对样品的光损害l同时检测5个真正的共聚焦通道l直观的操作界面激光扫描头结构激光扫描共聚焦显微镜 构成1.显微 镜2.扫描 头3.激光 器4.电脑激光器电 脑扫描头显微镜电脑显示屏激光扫描共聚焦显微镜 特点激光扫描共聚焦显微镜 优点l排除焦点外光信号干扰提高分

6、辨率改善视野广度和深度多重染色与适时多通道扫描一维到四维观察静态和动态观察活细胞分子变化观察定性定量定位分析激光扫描共聚焦显微镜的应用光学切片观察(细胞CT):激光扫描共聚焦显微镜可对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的系列光学切片。这一功能又被简称为“细胞CT”。影像三维重建通过薄层光学切片功能，可获得标本真正意义上的三维数据，经计算机图像处理及三维重建软件，可产生生动逼真的三维效果，从而能灵活、直观地进行形态学观察，并揭示亚细胞结构的空间关系。影像三维重建影像三维重建影像三维重建荧光的定量定位分析激光扫描共聚焦显微镜可对单、双或三 标的细胞及组织标本的荧光进行定量、 定位分析，也非常适合于高

7、灵敏度的快 速免疫荧光测定，可以准确监测抗原表 达、荧光原位杂交及细胞的形态学特性 并进行定量分析。细胞物理化学测定激光扫描共聚焦显微镜可对细胞周长、面 积、平均荧光强度等参数进行测。能对细 胞的溶酶体、线粒体、内质网、细胞骨、 结构性蛋白,DNA,RNA,酶和受体分子等细胞内特异结构的含量、组分及分布进行 定量、定性、定时及定位测定。细胞理化测定pH、细胞内离子分析利用荧光探针，激光扫描共聚焦显微镜可 对细胞内各种离子的含量及动态变化作毫 秒级定时定量分析，较多的是对细胞内钙 离子浓度及浓度变化的测量。利用BCECF 等探针可对细胞内pH进行测定。也就是说利用激光扫描共聚焦显微镜能进行细胞生

8、 理信号的动态监测。荧光漂白恢复(FRAP) 技术借助于高强度脉冲式激光照射细胞的某 一区域，从而造成该区域荧光分子的光 淬灭，该区域周围的非淬灭荧光分子将 以一定速率向受照区域扩散，用激光扫 描共聚焦显微镜可直接对此扩散速率进 行检测，由此可以研究细胞骨架构成、 核膜结构和大分子自组装等。FRAP技术FRAP技术FRAP技术细胞间通讯研究多细胞生物体中，细胞间相互影响和控制的生物学过程称为细胞间通讯，它被认为在细胞增殖和分化中起着非常重要的作用，激光扫描共聚焦显微镜可测量传递细胞调控信息的离子及分子。细胞间通讯研究Recovery of fluorescence10 seconds30 se

9、condsZero timeTimeIntense laser Beam Bleaches Fluorescence荧光能量共振转移（FRET）能量转移是能量从分子的一个部位向另一个 部位的传递，或能量从一个分子向另一个分 子传递。能量的提供者叫能量供体，能量的 接受者叫能量受体。荧光能量共振转移的条件l两个荧光分子：供体-FL1，受体-FL2l供体与受体的距离在2-7nml供体的发射波长与受体的激发波长一致荧光能量共振转移以FL1的激发波长的光照射样品，没有共振 转移时，只检测到 FL1的发射光(绿光)，发 生共振转移时，就可检测出FL1的荧光(绿光 )减弱，FL2(红光)的增强。DAr 2

10、R0Dr 2R0A荧光能量共振转移生物大分子结构和功能研究l蛋白质间相互作用研究,如蛋白分子构象 改变、大分子(亚基)的结合与分离、受体 与配体的结合等l核酸的结构和构型、核酸杂交分析l脂质的分布和传输、膜电位传感和膜融合 分析l自动DNA测序荧光染料荧光染料是能吸收光并能在较短时间内发射荧光的分子通常具有芳香环结构.荧光染料的选择l研究目的l可选探针范围l染料的性质l激光荧光染料的性质l光谱特性良好l荧光寿命长且稳定l量子产率高l分子小，易于与生物分子结合l不影响被结合生物分子的结构和特性l多重荧光之间尽量不发生相互影响检测核酸l共聚焦显微镜可定位、定性及定量检测核酸。常用于细胞核定位及其形

11、态学观察、检测细胞 内DNA状况及染色体定位观察等。l常用探针：PI (碘化丙啶)、Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI(4,6-联脒-2-苯基吲哚)检测蛋白质、抗原或受体l染料可与抗体、配体、肽、人工合成的寡核苷 酸等耦联。可用于免疫组化、荧光原位杂交、受 体标记，检测细胞表面抗原、胞内蛋白，细胞膜 表面受体等。l常用探针： FITC (异硫氰酸荧光素)、TRITC (四甲基异 硫氰酸罗丹明)、XRITC (异硫氰酸罗丹明X)、 Texas Red (德州红)、PE (藻红蛋白)、Cy5检测细胞器l部分探针可直接进入死细胞(包括固定细胞) 或活细胞 的胞膜，选择性

12、地与特定细胞器结合。此外，利用免疫荧 光技术可以标记细胞中任何细胞器。l常用探针： 线粒体：JC-1、Rhodamine 123 溶酶体：Neutral Red (中性红)、AO (吖啶橙) 内质网：DiOC6 高尔基体：NBD C6-ceramide、Bodipy FL C5-ceramide、Bodipy TR C5-ceramide实时动态监测活体细胞或组织功能l共聚焦显微镜可观察特异荧光探针标记的单个 细胞不同部位或不同组织区域接受刺激后的整个变 化过程，常用于对单个细胞内各种离子(Ca2+、 pH等)、膜电位、活性氧的比例及动态变化作毫秒 级实时定量分析。也可通过荧光漂白恢复实验检测

13、 细胞内、细胞间分子流动情况。l常用探针： Ca2+ ：Fluo-3、Indo-1、Fura-2 pH：BCECF、SNARF-1染料负载方法l样品为细胞还是组织l需负载的是所有细胞还是部分细胞l样品细胞的大小l染料分子的大小l负载对细胞活性和功能的影响l染料定量及定位的精确度孵育法，损伤导入法，转基因法荧光淬灭淬灭指荧光分子的不可逆破坏。其主要原因是：l光照促使处于激发态的荧光分子与其他分子相互 作用引起碰撞淬灭；l荧光分子与外部分子或离子形成非荧光复合物；l共振能量转移；lpH值、温度等环境条件的影响。防止淬灭的方法l降低激光强度l适当减少扫描时间l适当降低染料浓度l降低氧含量l使用防淬灭

14、剂(不适用于活细胞观察)串色的解决方法在两种或以上荧光探针之间，如果荧光发射峰很 近，那么荧光光谱彼此会有部分重叠，检测时可 能出现一种荧光探针的信号扩散到另一荧光通道 的情况。这种现象称为串色。串色的解决方法l光谱检测器l序列扫描l专业软件Dye Finder实习课内容 仪器演示l了解激光共聚焦显微镜的构造l了解激光共聚焦显微镜的用途l了解激光共聚焦显微镜的使用方法地点:科教楼重点实验室六楼仪器室教师：张朝良结束语激光扫描共聚焦显微镜是一种先进，高效 的研究仪器，在生物医学科学研究中有广 泛的用途，不仅可用于组织和细胞的二维 和三维形态结构研究，还可以对组织细胞 的生理活动进行动态观察，通过适当的荧 光探针与扫描方式的搭配，可以满足探讨 组织细胞内部诸多奥秘的需求。谢谢 谢！谢！