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1、 DNA的合成及重组DNA Biosynthesis and Recombination第十六章DNA生物合成DNA复制 （DNA指导的DNA合成）逆转录 (逆转录病毒RNA指导的DNA合成)校正复制中可能出现的错误，并修复受到损 伤的DNA细胞中酶促修复系统自然界DNA重组和基因转移的基本方式基因组复制的主要特点The General features of Genome Replication 第一节一、基因组是细胞或病毒全部遗传信息一、基因组是细胞或病毒全部遗传信息 的总和的总和 含有一种生物的一整套遗传信息的遗传物质，含有一种生物的一整套遗传信息的遗传物质， 称为称为基因组（基因组（g
2、enomegenome）。在真核生物体中，基因组。在真核生物体中，基因组 是指一套完整单倍体是指一套完整单倍体DNADNA（染色体（染色体DNADNA）和线粒体）和线粒体 DNADNA的全部序列，既包括编码序列，也包括非编码的全部序列，既包括编码序列，也包括非编码 序列。序列。二、基因组二、基因组DNADNA复制具备一些共同特征复制具备一些共同特征（一）基因组（一）基因组DNADNA都具有固定的复制起始点都具有固定的复制起始点 （二）复制过程中形成复制泡和复制叉（二）复制过程中形成复制泡和复制叉 （三）复制的基本单位称为复制子（三）复制的基本单位称为复制子 （四）半保留复制方式保证遗传信息的忠
3、实传递（四）半保留复制方式保证遗传信息的忠实传递 （五）半不连续复制克服了（五）半不连续复制克服了DNADNA空间结构对空间结构对DNADNA新链合新链合 成的制约成的制约 （六）复制起点由多个短重复序列组成（六）复制起点由多个短重复序列组成 （七）（七）DNADNA复制必须有引物复制必须有引物 复制起点（origin）：指DNA复制所必需的一段特殊的DNA序列。（一）基因组（一）基因组DNADNA都具有固定的复制起始点都具有固定的复制起始点双螺旋DNA复制时，复制区生长点的结构 呈Y形或叉形，称之为复制叉。（二）复制过程中形成复制泡和复制叉目 录从一个DNA复制起点起始的DNA复制区域，它是
4、一个独立复制单位，包括复制起点和终点。 复制子（replicon）（三）复制的基本单位称为复制子 （四）半保留复制方式保证遗传信息的忠实传递（1）全保留式（conservative），即恢复原来的 DNA双螺旋，并产生一个新的子代DNA双 螺旋；（2）半保留式（semiconservative），即新老搭 配，由一条新合成的DNA链和一条复制模 板链配对产生子代双螺旋DNA；（3）散布式（dispersive），即复制模板链被分 成许多小片段，散布于子代DNA中。两条新合成的DNA链和两条原来的复制模板 链之间的结合方式可能性：密度梯度实验 实验结果支持半保留复制方式含重氮-DNA的细菌培养于
5、普 通培养液第一代继续培养于 普通培养液第二代梯度离心结果前导链（leading strand）: DNA复制时，一条链 的合成方向和复制叉前进方向相同，可以连续复制合 成的新链。 后随链（lagging strand）:另一条链的合成方向 与复制叉前进方向相反，不能连续复制，只能分成若 干小片段分别合成，然后连接起来形成新链。后随链 中的小片段称为冈崎片段（Okazaki fragments)。（五）半不连续复制克服了DNA空间结构对DNA新链合成的制约前导链连续复制而后随链不连续复制，即DNA半 不连续复制。复制起点的一般特征: 由多个独特的短重复序列组成。 短重复序列被多亚基的复制起始因
6、子所识别并结合 。 一般富含AT，利于双螺旋DNA解旋，以产生单链 DNA复制模板。（六）复制起点由多个短重复序列组成（六）复制起点由多个短重复序列组成E.coli 复制起始点 oriCGATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 245同向重复序列 反向重复序列5 353酵母复制起点为自主复制序列（autonomously replicating sequences，ARS）： 酵母染色体含有多
7、个复制起点。 元件A(富含A/T的共有序列)：结合一个特异的蛋白质复合物复制起点识别复合物(ORC)。 3个序列(B1、B2和B3)可以增加复制起点的效率，其中B2的9个碱基与上述ARS共有序列相同。酵母复制起始点DNA聚合酶不能从游离的核苷酸开始合成 DNA链，必须由引物（primer）提供自由的3 -OH末端，通过加入核苷酸使之不断延伸。 所有细胞和多数病毒的DNA复制，首先利用 模板合成一段RNA引物，这一过程为引发（ priming）。 RNA引物5端的第一个核苷酸通常是pppA（ 个别为pppG）。（七）（七）DNADNA复制必须有引物复制必须有引物1.多数DNA复制使用RNA引物1
8、74等噬菌体以双链环形DNA的一条链上产生切口处的3-OH为引物；腺病毒及某些线性DNA病毒以结合于病毒DNA的5端磷酸基团的末端蛋白上的dCTP的3-OH为引物开始复制。2.个别DNA复制以DNA或核苷酸为引物三、不同基因组三、不同基因组DNADNA通过不同的模式通过不同的模式 进行复制进行复制（一）真核生物基因组（一）真核生物基因组DNADNA复制过程涉及反转录复制过程涉及反转录（二）基因组单链（二）基因组单链DNADNA通过复制中间体完成复制通过复制中间体完成复制（三）有的基因组（三）有的基因组DNADNA通过通过RNARNA中间体进行复制中间体进行复制（四）双链环状（四）双链环状DNA
9、DNA也有不同的复制方式也有不同的复制方式 四、不同基因组四、不同基因组RNARNA通过不同的通过不同的 模式进行复制模式进行复制（一）基因组双链一）基因组双链RNARNA复制过程是双链复制复制过程是双链复制 （二）基因组单链正链（二）基因组单链正链RNARNA以负链为模板进以负链为模板进 行复制行复制 （三）基因组单链负链（三）基因组单链负链RNARNA以正链以正链RNARNA为模为模 板进行复制板进行复制 （四）反转录病毒的基因组（四）反转录病毒的基因组RNARNA通过通过DNADNA中中 间体进行复制间体进行复制 DNA复制过程Process of DNA Replication第二节一
10、、原核生物一、原核生物DNADNA复制体现了复制的基本复制体现了复制的基本 过程和特征过程和特征（一）在复制起点解旋酶和多种因子形成复合物（一）在复制起点解旋酶和多种因子形成复合物1 1. E.col. E.coli i复制起始需要复制起始需要6 6种蛋白质因子种蛋白质因子 2. 2. 解螺旋酶激活引发酶形成引发体解螺旋酶激活引发酶形成引发体 3. 3. 解旋还需要促旋酶和解旋还需要促旋酶和SSBSSB DnaA、DnaB、DnaC、HU、促旋酶（gyrase，即拓扑异构酶）、单链DNA结合蛋白(single strand binding protein, SSB)DNA复制需要6种蛋白因子：
11、E.coli DNA复制起始 结合oriC的4个9bp反向重复序列形成复制起 始复合物。作用于oriC的3个13bp正向重复序列，DNA在 这3个位点解链，形成开放型复合物（open complex）。DnaA蛋白53解旋酶作用产生两条复制模板链激活引发酶DnaG蛋白DnaB蛋白与引发酶结合，形成引发体DnaB蛋白使一条DNA链围绕着另一条旋转，消除解 旋产生的张力。促旋酶SSB蛋白HU蛋白稳定解旋后的单链DNA构象，有助于解旋。DNA结合蛋白，对复制起促进作用。 HU蛋白能够使DNA发生折叠。E.coli 中DnaB结合引发酶DnaG，催化合成RNA引物，其序列始于pppAG，模板链序列3-
12、GTC-5，引物长度一般1112个碱基。（二）引发酶合成RNA引物负责切除RNA引物。（三）复制时聚合酶催化DNA合成而聚合酶切除引物DNA聚合酶可利用损伤尚未修复的DNA链 作为模板合成DNA，但不能修 复损伤。负责合成DNA。DNA聚合酶DNA聚合酶TLS1 Rev 1TLS，体细细胞高变变1Pol 相对对准确的TLS（穿越环环丁烷烷二聚体）1Pol TLS1Pol 体细细胞高变变（somatic hypermutation）1Pol 减数分裂相关的DNA损伤损伤 修复1Pol TLS1Pol DNA交联损伤联损伤 修复1Pol DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复4Pol DNA复制
13、，核苷酸切除修复，碱基切除修复23Pol 线线粒体DNA复制和损伤损伤 修复3Pol 碱基切除修复1Pol 合成引物4Pol 功 能亚亚基数目真核生物TLS（translesion synthesis）3Pol (UmuC, UmuD)DNA损伤损伤 修复，穿越损伤损伤 合成（TLS）1Pol (Din B)染色体DNA复制9Pol 全酶染色体DNA复制3Pol 核心酶DNA损伤损伤 修复1Pol 去除RNA引物，DNA损伤损伤 修复1Pol 功 能亚亚基数目原核生物（E.coli）原核、真核细胞DNA聚合酶的类型和功能目 录个核心酶1个-复合物（、 、 6种 亚基）可滑动的DNA夹子 （含1
14、对-亚基）DNA聚合酶全酶结构全酶结构包括：亚基（130 000）主要功能是合成DNA亚基具有35外切酶活性（校正功能）亚基可增强其活性亚基可能起组装作用核心酶由、和亚基组成：2个-亚基分别和1个核心酶相互作用，其 柔性连接区可以确保在复制叉1个全酶分子的 2个核心酶能够相对独立运动，分别负责合成 前导链和后随链。功能：-复合物是DNA夹子加载蛋白，负责将 可沿DNA链滑动的一对-亚基（DNA夹 子）加载于DNA，使DNA聚合酶具有 持续合成能力。-复合物由6种亚基组成：、在复制叉同时合成前导链和后随链35353535前导链 (leading strand)后随链 (lagging stran
15、d)解链方向冈崎片段3 553外切酶：去除RNA引物35外切酶：起校正作用DNA聚合酶活性：填补两个冈崎片段之间的缺口DNA聚合酶有3个酶促活性结构域:323个氨基酸小片段5 核酸外切酶活性大片段：Klenow 片段 604个氨基酸DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性N 端C 端枯草杆菌蛋白酶DNA-pol Tus蛋白具有反解旋酶（contra-helicase） 活性，识别并结合ter序列中共有序列，阻止 Dna B蛋白的解旋作用，从而抑制复制叉前进。 Tus蛋白除了使复制叉停止运动以外，还可 能造成复制体解体。(四) Tus蛋白识别复制终点使复制终止在复制叉汇合点两侧约100kb处各有一个 终止区（ter D/A和ter C/B）。当oriC处于半甲基化
