蛋白质的分离纯化

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1、第 七 章 蛋白质的分离、纯化 和表征 研究蛋白质的结构、性质和活性蛋白质 的功能，首先需要得到纯的、没有变性 的蛋白质样品。分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利 用蛋白质之间各种特性的差异，包括： 1.分子的大小和形状、 2.酸碱性质、 3.溶解度、 4.吸附性质 5.对配体分子的特异生物学亲和力。 第一节 蛋白质的酸碱性质 蛋白质的等 电点 n蛋白质分子由氨基酸组成，在蛋白质分子中 保留着游离的末端氨基和羧基以及侧 链上的各种功能团。蛋白质也是一类两性电 解质，能和酸或碱发生作用。可解离基团主 要来自侧链上的功能团 .n对某一种蛋白质来说，在某一pH，它所带的 正电荷与负电荷恰好相等，也即净

2、电荷为零 ，这一pH称为蛋白质的等电点（与蛋白质所 含氨基酸种类有关）。n蛋白质的等离子点是特征常数蛋白质的电泳n在等电点时(Isoelectric point pI)， 蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动 。n在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质 不同。在大于等电点的溶液中，蛋白质 粒子带负电荷，在电场中向正极移动； 在小于等电点的溶液中，蛋白质粒子带 正电荷，在电场中向负极移动。这种现 象称为蛋白质电泳(Electrophoresis) 。电 泳n利用蛋白 质的电泳 现象，可 以将蛋白 质进行分 离纯化。第二节 蛋白质分子大小的 测定常用测定方法：1、根据化学组成测定最低相对分子质 量 2

3、、凝胶过滤法测定相对分子质量 3、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相 对分子质量 4、渗透压法 5、沉降分析法（离心）一、根据化学组成测定最低相对 分子质量 用化学分析方法测定出蛋白质中某一 微量元素的含量，并假设蛋白质分子中 只有一个铁原子。则可以由此计算出蛋 白质的最低相对分子质量。 例如，肌红蛋白含铁量为0.335，其最 低相对分子质量可按下式算出： 最低相对分子质量= （铁的原子量/铁的 百分含量）X 100=（55.8/0.335） X100=16700二、凝胶过滤法测定相对分子质 量n凝胶过滤原理分子筛色谱 （凝胶过滤）利用Andrews的实验经验式：logMr = a/bVe/bV

4、oVe（elution volume）为某一溶质组分的洗脱体积。它是自加样品开始到该组分的洗脱 峰（峰顶）出现时所流出的体积。 V0 (outer volume)为外水体积，即存在于柱床中凝胶珠外孔隙的水相体积。测定出不能 被凝胶滞留的大分子溶质如蓝色葡聚糖 2000的洗脱体积可以决定V0。 logMr三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电 泳法测定相对分子质量聚丙烯酰胺凝胶电泳，（简称PAGE），也称圆盘电泳，它以聚丙烯酰胺凝胶（单体丙 烯酰胺Arc和交联剂甲叉双丙烯酰胺Bis共聚而成）为支持物 。蛋白质颗粒在各种介质中电泳时，它的迁移率决定于它所带的电荷以及分子大小和形状(电荷效应、分子筛效应)。如果

5、在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)和少量巯基乙醇，单体蛋白质或亚基的多肽链处于伸展状态，此时SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成复合体。结果：1、所有的SDS-蛋白质复合体都具有相同的荷质比。2、具有相同的构象。因此蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与原来所带的电荷和分子形状无关。 十二烷基磺酸钠原态蛋白质变性？磺酸基 极性亲水 烷基 亲油（蛋白质疏水区）在聚丙烯酰胺凝胶中由于引入凝胶的分 子筛效应，电泳迁移率与多肽链分子量 的对数有下列关系：log Mr = abR式中Mr为相对分子质量，a、b都是常数 ，R是相对迁移率：R = 样品迁移距离/

6、前沿（染料）迁移距离实验测定时，以几种相对分子质量标准物蛋白质的Mr的对数值对其R值作图，根据待测样品的R,从标准曲线上查出它的Mr。最准确可靠的方法是超离心法（Svedberg于 1940年设计）：蛋白质颗粒在2550*104 g离 心力作用下从溶液中沉降下来。沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。s = v 2xv =沉降速度（dx/dt） =离心机转子角速度（弧度/s）x =蛋白质界面中点与转子中心的 距离（cm）沉降系数的单位常用S，1S=110-13（s）蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系M = RTs D（1V）R气体常数（8.314107ergsmol -1 度-

7、1） T绝对温度 D扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机 转速很快，则忽略不计） V蛋白质的微分比容（m3g-1） 溶剂密度（20，gml-1）s沉降系数第三节 蛋白质的胶体性质 与蛋白质的沉淀一、蛋白质的胶体性质 蛋白质溶液是一种分散系统。蛋白质分子 颗粒是分散相，水是分散介质。就其分散 程度而言蛋白质溶液属于胶体系统。分散相质点在胶体系统中保持稳定应具备三个条件：A、分散相的质点大小在1-100nm范围 内。动力学上稳定，能作不断的布 朗运动。真溶液（1nm） 胶体溶液 悬浮液(100nm ） B、分散相的质点带有同种电荷，互 相排斥，不易聚集成大颗粒而沉淀 。 C、分散相的质点能与溶剂形成

8、溶剂 化层（如水化层）蛋白质溶液性质：1、蛋白质分子颗粒在1-100nm范围内。2、形成水化层：分子表面上亲水基团在水溶液中能与水分子起水化作用3、构成稳定的双电层：分子表面上的可解离基团，在适当的pH条件下，都带有相同的净电荷，与其周围的反离子构成稳定的双电层。+- - -+4、蛋白质溶液也和一般的胶体系统一样具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。二、蛋白质的沉淀 蛋白质在溶液中的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关，是有条件的、相对的。如果条件发生改变，破坏了蛋白质溶液的稳定性，蛋白质就

9、会从溶液中沉淀出来。n在温和条件下，通过改变溶液的pH或电 荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分 离。n在沉淀过程中，结构和性质都没有发生 变化，在适当的条件下，可以重新溶解 形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性 沉淀。n可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方 法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶 剂沉淀法等。可逆沉淀可逆沉淀n在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白 质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了 蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质 沉淀不可能再重新溶解于水。n由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和 性质的变化，所以又称为变性沉淀。n如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐 沉淀和生物碱试剂沉淀等都属于不可 逆沉淀。不可逆

10、沉淀不可逆沉淀沉淀蛋白质的方法有以下几种：(1) 盐析法 ： 向蛋白质溶液中加人大量的中性盐(硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等)，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。盐析沉淀一般不引起蛋白质变性。当除去盐后，又可溶解。(2) 有机溶剂沉淀法 极性有机溶剂(甲醇、乙醇或丙酮等)，因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。(3) 重金属盐沉淀法 (4) 生物碱试剂和某些酸类沉淀法 (5) 加热变性沉淀法几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。原 因可能是由于热变性是蛋白质天然结构解体 ，疏水基外露，因而破坏了水化层，同时由 于蛋白质处于等电点也破坏了带电状态（当

11、 处于等电点时）。少量盐类促进蛋白质的加热凝固 。（豆腐）我国很早就创造了将大 豆蛋白质的浓溶液加热并点入少量 盐卤(含MgCl2)的制豆腐的方法， 这是成功的应用加热变性沉淀蛋白 质的一个例子。 n点卤时，由于盐卤是电解质，它们在水里会分成许 多带电的小颗粒正离子与负离子，由于这些离 子的水化作用而夺取了蛋白质的水膜，以致没有足 够的水来溶解蛋白质。另外，盐的正负离子抑制了 由于蛋白质表面所带电荷而引起的斥力，这样使蛋 白质的溶解度降低，而颗粒相互凝聚成沉淀。这时 ，豆浆里就出现了许多白花花的东西了。盐卤里有许多电解质，主要是钙、镁等金属离子， 它们会使人体内的蛋白质凝固，所以人如果多喝了

12、盐卤，就会有生命危险。 第四节 蛋白质分离纯化的 一般原则分离纯化某一特定蛋白质 的一般程序可以分为：1、前处理 2、粗分级分离3、细分级分离 1、 前处理 (pretreatment) n分离纯化某一蛋白质，首先要求把蛋白质从 原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来 ，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性 。n动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织，n种子材料应先去壳甚至去种皮以免受杂质的 污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂 如乙醚等脱脂。n然后根据不同的情况，选择适当的方法，将 组织和细胞破碎。n动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破 碎或用超声波处理破碎。n植物组织和细胞，由于具有由纤维

13、素、半纤 维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要 用与石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研 磨的方法破碎，液氮破碎或用纤维素酶处理 也能达到目的。n细菌细胞的破碎的常用方法有超声波震荡， 与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理(以分解肽 聚糖)等。n组织和细胞破碎以后，选择适当的缓冲液把 所要的蛋白质提取出来。细胞碎片等不溶物 用离心或过滤等方法除去。 n如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分 ，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细 胞质等，则可利用差速离心方法将它们分开如果碰上所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结 合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚 ，然后用适当的介质提取。2、 粗分级分离 (r

14、ough fractionation) n当蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类 )获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋 白质与其他杂蛋白分离开来。n一般这一步的分级分离用盐析、等电点沉淀 和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特 点是简便、处理量大，既能除去大量杂质(包 括脱盐)，又能浓缩蛋白质溶液。n有些蛋白质提取液体积较大，又不适于用沉 淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、冷冻真 空干燥或其他方法(如聚乙二醇浓缩法)进行 浓缩。3、 细分级分离 (fine fractionation) 进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲 和层析等。必要时还可选择电泳法，包

15、 括区带电泳、等电聚焦等作为最后的纯 化步骤。用于细分级分离的方法一般规 模较小，但分辨率很高。 4、 结晶 n结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，蛋白质 纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。尽管结晶并 不能保证蛋白质一定是均一的，但只有某种蛋白 质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。n由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质 的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处 于天然状态的有力指标。n结晶也是进行X射线晶体学分析所要求的，结晶的最佳条件是使溶液略处于过饱和状态，此时较 易得到结晶。接入晶种常能加速结晶过程。 第五节 蛋白质的分离纯化方法 几种常用的蛋白质纯化方法：根据蛋白质在溶液中的性

16、质分离纯化蛋白 质的方法：分子大小； 溶解度； 电荷； 吸附性质； 对配体分子的生物学亲和力等。 一、根据分子大小不同的纯化 方法 n1透析和超过滤透析(dialysis)是 利用蛋白质分子 不能通过半透膜 的性质，使蛋白 质和其他小分子 物质如无机盐、 单糖等分开。常 用的半透膜是玻 璃纸和其他改型 的纤维素材料。超滤是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。2密度梯度(区带)离心 n蛋白质颗粒在具有密度 梯度的介质中离心时， 质量和密度大的颗粒比 质量和密度小的颗粒沉 降得快，并且每种蛋白 质颗粒沉降到与自身密 度相等的介质密度梯度 时，即停止不前，最后 各种蛋白质在离心管中 被分离成独立的区带， 密度梯度n常用的密度梯度有蔗 糖梯度，聚蔗糖梯度 。n蔗糖便宜，纯度高， 浓溶液(60，WW) 密度可达1.28 gcm3 。n聚