如何设计有效的siRNA

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1、如何设计高效的siRNA许德晖 西安交大医学院遗传教研室 1 RNA干扰的发现过程 2 RNA干扰的机制 3 siRNA的设计1.建立数据库进行统计学分析2.mRNA二级结构的预测与影响3.risc装配siRNA的不对称性4.argo蛋白的paz及piwi结构域5.错配的影响及脱靶的控制6.排除无效的siRNA7.各种化学修饰的影响8.一些siRNA设计网址及软件RNAi的发现 RNAi现象早在1993年就有报道： 将产生 紫色素的基因转入开紫花的矮牵牛中，希 望得到紫色更深的花，可是事与愿违，非 但没有加深紫色，反而成了白色1。当时 认为这是矮牵牛本来有的紫色素基因和转 入的外来紫色素基因都

2、失去了功能，称这 种现象是“共抑制”。 1995年，康奈尔大学的Su Guo博士用反 义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现， 反义和正义RNA都阻断了基因的表达，他 们对这个结果百思不得其解。 反义RNA 基因沉默 正义RNA 也沉默了 ? 为什么正义的RNA也会导致沉默? 寻找原因:传统的RNA提纯方法有缺陷,总是会 混有少量的dsRNA 纯化RNA 真正的结果出来了 1998年， Andrew Fire的研究证明，在正义 RNA也阻断了基因表达的试验中，真正起作用 的是 双链RNA。这些双链RNA是体外转录正义 RNA时生成的 反义RNA 中等沉默效应 正义RNA 几乎没有效应 双链RNA

3、 强大的沉默效应 结论:真正起作用的是纯化过程中混杂的少量 dsRNA RNA干扰理论诞生了 随后的研究中发现，RNAi现象广泛存在 于线虫，果蝇，斑马鱼，真菌以及植物等 生物体内，这些生物体利用RNAi来抵御 病毒的感染，阻断转座子的作用。 那么,哺乳动物中有没有RNAi呢? 把长的dsRNA(以前的实验都是这样做的) 导入哺乳动物成体细胞后，发现细胞内的 病毒防御机制被激活。产生了干扰素样反 应，蛋白激酶PKR激活，使转录因子E2F 被抑制，非特异的阻断基因的转录，并诱 导细胞凋亡 结论:哺乳动物不存在RNAi 认为: 随着生物的进化,高等动物完善的免疫系统 取代了低等生物内RNA干扰所担

4、负的抵抗 病毒和外源性微生物侵袭的功能，因此， RNA干扰机制在高等动物体内不再存在。 真的是这样的吗？ 那为什么试验会没有结果？ 会不会是我们在实验设计及方法上有所缺 陷（像上面那个实验）？ tuschl做到了 他们通过分析在低等生物和植物体内自然 产生的执行RNA干扰功能的中介分子- siRNA分子，发现这些都是21-28个nt的 小双链RNA，每链的3端都有2-3个的悬 垂核苷酸，5端第一个核苷酸都被磷酸化 了。这种结构都是Dicer等RNA酶切割 dsRNA后产物所特有的。 如果直接导入siRNA分子呢？siRNA分子 足够小，不会引起干扰素样反应。会出现 什么结果。 根据siRNA的

5、共同特点，通过化学合成， 直接把siRNA导入哺乳动物细胞内。 发现：siRNA能够高效抑制目的基因的表 达，而且是通过标准的RNA干扰途径！ 从此打破了RNAi不存在于哺乳动物的论 断，RNAi被广泛用于哺乳动物的基因功 能研究。 tuschl的设计原则也被认为是经典的 siRNA设计原则 tuschl的siRNA经典设计原则 1 从起始密码下游50100nt开始搜索， 避免5或3端的UTRs，因为有蛋白结合位 点。 2 搜索5AA（N19）UU序列 没有的话也 可以用5AA（N21）或5NA（N21）保证 G/C含量50%左右，最好能在32%-79% 之间 3 Blast对照，确定只有目标

6、基因与其互 补 4 设置对照siRNA，最好是针对细胞内所 没有的基因 RNAi的机制 1） 起始阶段：dsRNA进入细胞的方式可 以是外源导入或者转基因、病毒感染等。 引入的dsRNA被核酸酶RNase家族中特 异识别dsRNA的Dicer 酶,以一种ATP依赖 的方式逐步切割成长约21-23nt的由正反 义链组成的双链小分子干扰RNA(siRNA) ，且每条单链的3端都带有2个突出的非 配对碱基（多数是UU）。siRNA又被称为 引导RNA（guide RNA）,是识别靶RNA 的标志。siRNA的生成启动了RNAi反应。 RNAi的机制 2) 效应阶段：siRNA结合一个核酶复合物 ，形

7、成所谓的RNA诱导的沉默复合物（ RNA-induce silencing complex,RISC）。 这个核酶复合物由内切核酸酶、外切核酸 酶、解旋酶和同源RNA搜索活性蛋白四种 成分组成。激活该复合物需要一个ATP依 赖的 将siRNA解双链的过程，活化以后的 RISC定位到与siRNA中的反义链互补的靶 mRNA转录本上，并在距离siRNA3 端 12个碱基的位置切割 mRNA。另外，通 过遗传分析方法发现，线虫中的RDE-1、 MUT-7和DNA/RNA解旋酶及其他 PAZ/Piwi蛋白也参与到该阶段的反应。 siRNA的设计 一 建立数据库进行统计学分析 1，分析了针对2个基因的1

8、80条siRNA，得 出了8点有效siRNA的设计原则 2，分析了针对92个基因的398有效的 siRNA,得出7条规律，但是他完全是从能 量方面考虑的。3,分析了46条，并用独立的34条来验证， 得出的3点规律 4，通过人工神经网络（人工智能）来自动 设计有效的siRNA 1 低GC含量，30-52% 2 有义链15-19至少有3个AU配对 3 避免出现倒置重复，会形成发卡 4 有义链19位为A 5 有义链3位为A 6 有义链10位为U 7 有义链19位非G或C 8 有义链13位非G 返回 总的siRNA双链能量50%) AC错配及GU错配可以很好的被容忍 错配有位置效应的 1, ss5-1

9、1最好完全配对,但 5,7,8,11也可 以被容忍2, 3,4,12-17可以被中度容忍3, 1,2,18,19可以高度容忍返回 当前,我们都是用blast对照来设计siRNA, 防止off-target的发生.但是blast对错配1-2 个的控制并不令人满意. 我们可以用这个寻找相似的mRNA软件来 过滤候选siRNA.(和blast的对比结果) 所以 ,siRNA设计时最好通过这个软件 再对照一下，把错配 1-2个的候选siRNA也尽量不要 脱靶预测网站,通过分析大量的具有潜在高 off-target的siRNA,得到规律用来预测 (http:/rnai.cs.unm.edu/rnai/o

10、ff-target ) 这些是通过blast对照过的(已发表的),但通过这个软件,我们仍然可以找到一些 和他只错配1-2个的mRNA,而这将有可能引发潜在的off-target效应返回 siRNA的设计六 排除无效的siRNA 用已知的数据库来检测各种筛选原则,发 现总是会包含一些无效的siRNA,所以他们就 把重心放在排除无效的siRNA方面, The algorithm is based on two observations, namely repelling loops and big repelling loops,on secondary structures of the tar

11、get mRNA. 反向思维,有时候我们可以逆向思考,也许又 是一片新的天空!根据mRNA二级结构预测结果来排除无效的siRNA siRNA的设计七 各种化学修饰的影响这更主要的是用于siRNA治疗时,能够提 高siRNA的稳定性,延长半衰期,从而增加 其沉默基因的效能1 , 4位的硫修饰可以增加siRNA的稳定 性2 , Locked nucleic acid (LNA)与siRNA 结合,增加稳定性3 , 磷酸骨架的修饰4 , 2戊糖环的修饰 有义链的硫化可以被容忍，但反义链硫化 会有位置及个数的影响,不过硫化比2-O甲 基化的容忍度要高 各个位置的硫化对结果的影响黑体碱基代表硫化修饰硫化

12、修饰与不修饰在沉默平均水平上有显著差别LNA是人工合成的对RNA高亲和力的核酸类 似物,一般修饰在siRNA的两端,这样就不容易被 体内的核酶降解了延长siRNA的半衰期返回 磷酸骨架的修饰 戊糖2位的修饰 siRNA的设计八 一些siRNA设计网址及软件1, DEQOR http:/cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html 2, siDirect (http:/design.RNAi.jp/)有脱靶控制, 但是选择有效的原则简单3, Web Server (http:/jura.wi.mit.edu/bioc/siRNA) 有 SNP控制4, (http:/

13、io.es) 有效选 择原则较为完整返回 筛 选 有 效siRNA 的 一 般 过 程返回有效siRNA选择原则脱靶控制 ,blast无法检测出来 (7个) 返回 siRNA设计方法,每一种都有他各自的特点 ,要综合考虑,能够减少研究时间,费用,还能 确保基因沉默效应,并把脱靶的不良效应控 制到最低水平. 由此,我们在前人的研究经验基础上,综合 权衡各个条件,优化了选择原则,并拟合了 自己的有效siRNA选择原则 有效siRNA选择原则 1, 从起始密码下游50100nt开始，避开 5或3端的UTRs , 选择AA(N19) 2, 有义链1位为GC配对,19为AU配对,双 链5端能量应该比3端高,即15-19至少有3 个AU配对,或13-19至少有5个AU配对 3, siRNA5端必须磷酸化,3端最好是悬垂 两个dTdT,而不是UU 4, 对mRNA目标区域进行二级结构预测, 排除那些具有复杂二级结构的 5, Blast对照,并进一步用mRNA相似性及 脱靶控制筛选,把off-target控制到最小 6, 避免出现连续的9个GC配对,GC含量 最好在30%-52%之间,16位最好为C,13位 最好为非G 7, 双链siRNA可以设计为叉状,有义链3 端与反义链5端不配对,利于解链