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1、电镜技术与细胞超微 结构基础Base of Electron Microscopy and Cell Ultrastructure前 言n 电子显微镜（Electron Microscope , EM)简 称电镜，它是用电子束代替可见光的显微装 置，一种高放大、高分辨的大型精密仪器。 目前电镜已广泛应用于包括医学在内的各个 领域。 EM在光学显微镜基础上使细胞学的概 念更加完善，对疾病的认识,特别是对发病机 理的研究做出了巨大贡献.为人类认识自我发 挥了重要作用。第一讲 电镜基本原理及在医学中的应用n一、细胞学理论的发展史（显微镜的发展史）人眼分辨率:0.2mm17世纪中叶Hooke（1665
2、）发明 L.M:0.2um19世纪中叶1861 细胞学说建立 1932年Ruska 和 Knoll 发明了E.M , X 121935年E.M基本定型 1939年第一台商品电镜(德国西门子公司） 分辨率 优于10nm二、电镜基本工作原理n 电子显微镜与光学显微镜不同之处在于用电子束 光源代替了可见光光源,通常使用热电子发射的方法产 生电子束,电子束具有以下基本特性: （1）.电子束由电子组成，快速运动的电子在真空中呈 直线前进，并具有波动性，其波长与加速电压有关。 （2).电子束在电场或磁场中，会受到电力或磁力的作用 。（3）.电子束能穿过极薄的样品，并产生二次电子 ，背散射电子，特征X射线等
3、。因此基于这些特性设计出的电子显微镜结构非常复 杂。(一）分辨率、反差与形态研究的关系光学显微镜的分辨率比较低，只能观察到大于 0.25um的结构，主要受透镜的像差和光波的衍射影 响,要观察细胞内和细胞间许多结构则无能为力。 什么是分辨率呢？1、分辨率（Resolution）又称分辩本领（Resolving power），是将邻近两点清晰区分、辩 认的能力，用能被辨认的邻近两点的距离表示。肉眼：在明视距离（25cm）时，为0.25mm；LM：可见光的平均波长为500nm，r=/2，LM的 极限分辨率为0.25um; EM：电子波波长短,且波长随加速电压的增高而更 短，目前较好的电镜分辨率为0.
4、2nm左右,比LM提 高1000倍,比人眼提高100万倍.(注)：由于电镜存在各种像差（包括球差、像 散等）,限制了分辨率,不能真正达到其波长的一半 ;分辨率还受到许多因素的影响,如切片 的厚度等，超薄切片较薄时,分辨率可达1 2.5nm,切片较厚时,实际分辨率为510nm. 2、反差：被观察物与其背景在亮度（黑白对比度）上有所不 同，这种差别称为反差；透射电镜的反差主要由样品 对电子的散射产生。3、空放大不能提供更为清晰的图像放大，称为无效放大。4、不同分辨率的形态研究（二）、亚微结构与超微结构的概念及 关系亚显微结构（submicroscopic structure）：介于细胞水平和大分子
5、水平之间的结构；简称 为“亚微结构”或“亚细胞结构（subcellullar structure） ”，也称“细微结构（fine structure）”超微结构（ultrastructure）：严格的讲，是指分子水平的结构，目前一般书 刊对亚显微结构和超微结构无严格的界限，往往将 普通光镜分辩界限以下的结构笼统称为超微结构。（三）、电镜工作原理（与光镜的比较）1、电镜与光镜光路图的比较电子显微镜 光学显微镜 照射 电子束 光束 波长 0.859nm(20kV) 500nm(可见光)0.37nm(100kV) 200nm(紫外光) 介质 真空 空气 透镜 电磁透镜 玻璃透镜 聚焦 电聚焦 机械
6、反差 散射吸收、衍射、相位 吸收、反射 显像方式荧光屏 直接观察2、电镜的分类（1）透射式电子显微镜（Transmisson EM）（2）扫描电子显微镜（Scanning EM）（3）分析电子显微镜（Analytical EM）（1）、透射式电子显微镜I、TEM的基本结构照明系统（真空系统）样品室成像系统观察记录系统II、透射电镜的成像原理III、透射电镜的用途（2）扫描电子显微镜I、SEM的基本结构照明系统（真空系统）扫描系统检测器II、SEM的成像原理III、SEM的用途（3）、分析电子显微镜分析电子显微镜是透射电镜或扫描电镜与X射线显 微分析仪相组合的一部信息综合分析仪。 X射线显微分
7、析仪是通过测量X射线信号的能量和强度分布对样品进 行化学成分分析的仪器。它具有分辨率高、使用方便、 分析结果准确等特点。I、波谱仪（wavelength-dispersive spectrometer ， WDS）II、能谱仪（energy-dispersive spectrometer ，EDS） 三、电镜在医学中的应用n 电子显微镜的问世为人们探索微观世 界的奥秘开辟了新纪元。半个多世纪以 来，电镜技术的飞跃发展，已使电镜的 应用范围越来越广泛，涉及到医学、工 业、农业、地质及生物学等各个领域。 电镜在医学上的应用开始于上个世纪40 年代，在病毒学、细胞生物学、组织学 、病理学、分子生物学
8、及分子病理学上 均作出了卓有成效的贡献。近20年来, 从 基础理论研究又扩展到了临床医学的实际应用方面, 如疾病的病情 判断、病因鉴定、对肿瘤、血液病及肾脏疾病的诊断和分型等。1、电镜在医学上作用和局限性电子显微镜问世以后才有条件对小于细胞的结构进行研究，其 中包括生物大分子、病毒、原核细胞和真核细胞及细胞器。（1）、科研：I、正确认识电镜的作用电镜是一种先进的科学仪器，其主要特点是分辨率高，能观察细 微结构。但正是由于其高放大，使得观察范围较小，且制样复杂 。而光镜则有制样简单，观察面大，能动态观察活细胞等优点。因此电镜不能取代光镜，二者应配合使用，取长补短. 电镜是一种先进的科学仪器，其主
9、要特点是分辨率高， 能观察细微结构。但正是由于其高放大，使得观察范围较 小，且制样复杂。而光镜则有制样简单，观察面大，能动 态观察活细胞等优点。因此电镜不能取代光镜，二者应配 合使用，取长补短。l在科学研究中，电镜所起作用具体表现为：a、探查作用：观察很早期的改变，功能活动的提示，因 复杂的代谢过程中的定位往往是光镜看不见的；病毒学、 病因学、免疫损伤等病因的探讨；b、依据作用：“眼见为实”的重要性，在机理研究中从形 态学上证实了许多理论假说；C、辅助作用：电镜结果注意与光镜的关系，与宏观的 关系，因其本身有较大的局限性，如取材小，观察范围亦 小，特别是在病理诊断上应与其他方法结合进行研究。I
10、I、确定适当的电镜III、采用适当的电镜制样方法（2）、临床诊断I、正确认识电镜的高放大性能与电镜取材 的局限性的关系II、强调取材部位的准确性III、要有丰富的超微组织学和病理学知识IIII、结合光镜结果及细胞化学结果做出诊 断2、电镜观察要领及学习方法（1）、观察要领I、合理运用放大倍数II、观察时要有全局观点和整体观念III、避免长时间观察某一局部，有价值的 信息应尽快拍照IIII、注意识别人工假象 （2）、学习方法（图像识别）I、明确照片是由那一类电镜拍摄II、什么制样方法III、放大倍数大概是好多IIII、大概确定组织或细胞类型IIIII、组织或细胞是否正常，有何异常四、细胞超微结构
11、研究的展望n1、从二维到三维的发展n2、从单纯形态观察到对其功能、代谢、 化学组成、分子结构及元素份析的研究n3、从定性描述到定量测量的发展n4、从经过化学固定的结构到活细胞整体 方向发展n本课程的重点内容 电镜生物样品制备常规技术及应用范围; 电镜图片的分析要领; 正常细胞超微结构理论和超微病理内容的基本掌握。n学习要点 重视图像的分析和识别； 注意LM和EM结合； 形态与功能的联系； 正常超微结构与超微病理的联系； 建立整体的细胞结构和功能概念。n主要参考文献 电子显微镜术在临床医学的应用,杭振镳 蔡文琴主编,重庆出版社 ,1988年8月,第一版； 医学细胞生物学,宋今丹主编,人民卫生出版社,1997年5月,第一版 ； 医用电子显微学，薄爱华主编,人民卫生出版社,2000年11月,第一 版； 超微病理学基础,武忠弼主编,人民卫生出版社,1990年9月,第一版 ； Ultrastructural Pathology of the Cell and Matrix . Third Edition Vol.1 Feroce N,Ghadially Butterworths 1988思考题:1、为什么电子显微镜的构造比光学显 微镜复杂得多？2、为什么电子显微镜应用在医学上比 发明要晚得多？3、透射电镜和扫描电镜的成像原理用 途、图像特征有何异同？谢 谢！
