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1、第 1 页 共 7 页 DNA 条形码技术在药用植物鉴定中的应用1DNADNA 条形码技术在药用植物鉴定中的应用条形码技术在药用植物鉴定中的应用李宏富 刘滨（宁夏大学 生命科学学院，宁夏 银川，750021）摘 要：由于很多常用药材来源繁多，导致市场上品种混乱，药材质量参差，需要准确、快速、可靠的鉴定与质量评价体系。因此，本文提出建立药材鉴定与质量评价的 DNA 条形码系统的解决方法，以期为药材的准确鉴定与全面质量评价提供新途径。关键词：DNA 条形码技术 药用植物 鉴定中药材质量不稳定仍是中药发展面临的一个重大问题，造成这个问题的一个主要原因是同种药材来源复杂。很多情况下，多种同属植物作为一
2、种药材使用，而其鉴别与质量控制都尚难尽如人意。例如常用中药甘草，为豆科甘草属（Glycyrrhiza L.）多年生草本植物，中国药典 2005 年版（一部）收录中药甘草的原植物为乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.） 、胀果甘草（G.inflata Bat.） 、光果甘草（G.glabra L）的干燥根和根状茎可作为药材甘草使用。而其它甘草属植物众多，由于药材之间形态、结构极近似，性状、显微（组织构造和粉末）等传统鉴定方法有比较大的难度，即使是有丰富经验的专业人员或药师，也费时费力，并且不能保证精确无误。同时，其它甘草属植物中药用成分甘草酸与甘草苷的含量远低于药
3、用甘草，造成市场上品种混乱，药材质量极不稳定。为此对药材原植物的鉴定和限制已到了刻不容缓的地步。因而，有必要建立更加准确、快速、可靠的多来源药材鉴定和质量评价体系。DNA 条形码技术（2003 年,Herbert）是通过对一个标准目的基因的 DNA 序列进行分析从而进行物种鉴定的技术。这个概念的原理与零售业中对商品进行辨认的商品条形码是一样的。简单地说，DNA 条形码技术的关键就是对一个或一些相关基因进行大范围的扫描，进而来鉴定某个未知的物种或者发现新种。因此，笔者认为，可尝试建立一种 DNA 条形码系统，即利用标准的、具有第 2 页 共 7 页 DNA 条形码技术在药用植物鉴定中的应用2足够
4、变异的、易扩增且相对较短的 DNA 片段在物种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统,用于类似甘草这的多来源药材的鉴定和质量评价。1 DNA 条形码1.1 DNA 条形码的概念DNA 条形码技术是近年来随着分子生物学技术和生物信息学的发展，出现的对生物进行鉴定和分类的技术。DNA 条形编码或称 DNA 条形码技术(DNA barcoding)是利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的 DNA 片段(DNA barcode)自身在物种种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统，它可以对物种进行快速的自动鉴定。DNA barcoding 的概念由加拿大动物学家
5、 Paul Hebert 于 2003 年首次提出。Paul Hebert 等对动物界包括脊椎动物和无脊椎动物共 11 门 13 320 个物种的线粒体细胞色素 c 氧化酶亚基1（Cytochrome c oxdase I，CO I）基因序列比较分析，除腔肠动物 Cnidaria外，98%的物种遗传距离差异在种内 0%-2%，种间平均可达到 11.3%，据此提出可以用单一的小片段基因来代表物种；他们将超市用以区分成千上万种不同商品的条形码概念引入，把这种小片段基因序列称作物种的 DNA 条形码（DNA barcodes）并提出为全球生物编码的计划。1.2 DNA 条形码的原理DNA 是生物的遗
6、传信息载体。遗传信息的不同，决定了生物的多样性。由于每种生物物种的 DNA 序列都是唯一的，就给 DNA 条形码提供了物质基础，每个位点上都有 A、T、G、C 4 种选择，理论上讲，45 个碱基长度的 DNA 序列通过不同排列组合就可以获得 10 亿种可选择的编码。但是，由于部分碱基的保守性，几十个碱基的长度不能提供足够的编码信息，而现代分子生物学的发展，扩增几百个碱基长度的序列已经很容易了。所以，目前的 DNA 条形码分析都是基于几百个碱基长度的 DNA 序列。1.3 DNA 条形码的标准及优点Kress 等(2005)和 Taberlet 等(2007)提出了理想的 DNA 条形码标准，综
7、合起来有以下几点：(1)可以区分物种的足够变异和分化，同时种内变异必须足够小；(2)有高度保守的引物设计区以便于设计通用引物；(3)片段足够短，以便第 3 页 共 7 页 DNA 条形码技术在药用植物鉴定中的应用3于 DNA 提取和 PCR 扩增，尤其是对部分降解的 DNA 的扩增。生命条形码联盟(consortium for the barcode oflife,CBOL)阐述了 DNA条形码的优点，概括起来有以下几点：(1)以 DNA 序列为检测对象，其在个体发育过程中不会改变。同种生物不同生长时期的 DNA 序列信息是相同的，即使经过加工，形态发生变化，而 DNA 序列信息不会改变，较之
8、传统的方法，扩大了检测样本的范围；同时样本部分受损也不会影响识别结果。(2)可进行非专家物种鉴定。该技术是可机械重复的，只要设计一套简单的实验方案，经过简单培训的技术员即可操作。(3)准确性高。特定的物种具有特定的 DNA 序列信息，而形态学鉴别特征会因趋同和变异导致物种的鉴定误差。(4)通过建立 DNA 条形码数据库，可一次性快速鉴定大量样本。分类学家新的研究成果将不断地加入数据库，成为永久性资料，从而推动分类学科更加快速深入地发展。1.4 DNA 条形码的操作及分析方法DNA 条形码的操作过程与分子生物学实验类似，包括采集材料并提取 DNA、利用通用引物 PCR 扩增目的片段、纯化 PCR
9、 产物、序列测定与分析以及提交结果到相关数据库。条形码的应用目标是所有物种，并且每个物种需要多份材料。采集材料时应以传统的形态分类学知识为依据，尽可能地涵盖传统分类学中的变异式样，材料来源范围越广泛,得到的结果就越具说服力。通常认为每个物种至少需要 10 份材料，并最好包括 5 个不同居群，这样既可以发掘出变异程度较低的种内变异，又可以更准确地计算出种内遗传距离。生物条形码工程的首要目标是建立可用来作为鉴定标本工具的基因序列数据库。目前只建立了动物条形码数据库，植物条形码尚处于评估阶段，只有该技术在植物中进一步完善后才有可能建立相应的数据库。序列数据分析是 DNA 条形码探索的最重要环节，由于
10、植物的种间杂交现象比较普遍，因此植物条形码的分析方法也处于不断的摸索中，目前报道的分析方法基本分为以下几步。(1)序列比对和人工校正。一般采用 Clustal W，生命条形码数据库中使用Hidden Markov Models 行序列比对，也可以 BLAST search 在 Genbank 中搜索相似的基因片段对比片段信息的可靠性。(2)遗传分析。计算遗传距离是条形码分析的重要手段，当前植物条形码探第 4 页 共 7 页 DNA 条形码技术在药用植物鉴定中的应用4索还处于对不同片段的评价阶段，需要对不同片段的种间和种内变异进行对比，以选择最佳的片段或片段组合。种间距离基本采用 Kimura-
11、2-parameter distance(K2P)模型计算。该模型也是生命条形码联盟(CBOL)建议使用的遗传距离计算模型。理想的 DNA 条形码检测到的种间遗传变异应明显大于种内遗传变异，且会形成一个明显的间隔区，在理想状况下，柱形图上的种内变异会集中在数值较小的一侧，而种间变异则集中在数值较高的一侧。(3)系统学分析。采用标准的系统学分析方法，建立系统发生树，检验同一个物种的不同个体能否聚在一起。Lahaye 等(2008a)使用 PAUP4b10*建树分析，结果发现 MP 树和 UPGMA 树可以得到较高的物种正确识别率，并进行了聚并分析(coalescence analyses)，检验
12、每个条形码，验证那些从一个独立的聚并过程得到的聚类群是否与以前识别的物种分类相匹配。2 DNA 条形码在植物中的研究现状在植物中 DNA 条形码的研究进展相对缓慢，主要有两方面原因：(1)植物线粒体基因组进化速率较慢，遗传分化小，因此动物中的标准片段 COI 不适用于植物；(2)系统学研究中常用的片段变异较小，不适合用作条形码片段(Chase et al.,2005;Kress etal.,2005)。由于核基因组通常具有多拷贝的特性，且物种内变异较大，引物通用性差，并且扩增时对模板 DNA 的质量要求高，不适用于存在 DNA 降解的材料(Kress et al.,2005)，因此，植物中最可
13、能的条形码还是从叶绿体基因组中选择(Chase et al.,2005;Cowan et al.,2006)。生物条形码联盟(CBOL)最初建议的植物条形码片段均为叶绿体段：matK，rpoC1，rpoB，accD，nhdJ 和 YCF5。但因为后 3 个片段在一些主要的植物类群中有缺失，如 YCF5 在苔藓类植物中缺失，accD 在禾本科植物中缺失，而 ndhJ 在松属植物中缺失，在部分兰花中变短或功能丧失，因此它们在第二阶段的更新中已被排除。由于越来越多的研究表明单靠某一个片段不太可能对所有的植物物种进行准确鉴定，研究者又相继提出了不同的片段组合方案。片段组合方案最早由 Kress 等(2
14、005)得提出，Kress 等通过对 53 科 88 属99 个物种的 9 个质体基因片段(trnK-rps16、trnH-psbA、rp136-rps8、atpB-第 5 页 共 7 页 DNA 条形码技术在药用植物鉴定中的应用5rbcL、ycf6-psbM、trnV-atpE、trnC-ycf6、psbM-trnD 和 trnL-trnF)和核基因ITS 序列进行分析，认为被子植物中普遍存在杂交和多倍体现象，某一个片段不太可能对所有的植物物种进行准确鉴定，因此提出了片段组合方案,并预测ITS+trnH-psbA 组合将在有花植物(flowering plants)中有较广泛的应用价值。Ru
15、binoff 等(2006a)认为可以用 rDNA 作为质体基因的补充，作为未来使用的低拷贝核基因标记。但由于核基因本身具有多拷贝的特性，扩增时对 DNA 要求较高，部分降解的 DNA 材料扩增效果较差，并且长度变异大，存在长的 poly-G、poly-C 和 poly-A 结构等，其作为植物条形码候选片段存在较多的限制。而全球大部分植物都包含叶绿体，且叶绿体基因组是单亲遗传，避免了基因重组的影响。因此，应在叶绿体基因组中寻找植物条形码片段，片段组合方案也是目前学者研究的重点。现有的研究报道了在 2 种组合方案中选择片段的方法，分别是 Chase 等(2005)提出的交通灯法(traffic
16、light approach)和 Newmaster 等(2006)提出的等级(tier)分类法。2007 年 9 月，在台北举行的第二届国际生命条形码大会上，总结了 5 种片段组合，分别是：Chase 等(2007)提出的 rpoC1+rpoB+matK或 rpoC1+matK+trnH-psbA；Kress 和 Erickson(2007)提出的 rbcL+trnH-psbA，其可以对陆生植物进行识别和鉴定；韩国植物学家 Ki-Joong Kim 等提出的matK+atpF-atpH+psbK-psbI 或 matK+atpF-atpH+trnH-psbA(Pennisi,2007)。片段组合方案为植物条形码研究指出了一个新方向，但现有的研究结果并不能满足 DNA 条形码标准，仍需要大量的实验数据去验证它们的物种识别和鉴定能力。作为研究重点的片段组合还需要更深入的研究。Chase 等(2007)提出的 2个组合在 Sass 等(2007)和 Fazekas 等(2008)的研究中识别能力并不很理想。对于 Ki-J
