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1、RNA干扰技术与应用 RNAi(RNA Interference )刘永超法尔目前任职于美国麻省理工学院,梅洛目前在美国哈佛大学法尔目前任职于美国麻省理工学院,梅洛目前在美国哈佛大学 工作。他们将分享工作。他们将分享10001000万瑞典克朗(约合万瑞典克朗(约合140140万美元)的奖金。万美元)的奖金。 20062006年年1010月月2 2日,瑞典卡罗林斯卡医学院宣布将日,瑞典卡罗林斯卡医学院宣布将20062006年度诺贝尔年度诺贝尔 生理学或医学奖授予两名美国科学家安德鲁生理学或医学奖授予两名美国科学家安德鲁法尔和克雷格法尔和克雷格 梅洛,以表彰他们发现了梅洛,以表彰他们发现了“RNA
2、RNA(核糖核酸)干扰(核糖核酸)干扰”机制。机制。 诺贝尔奖评审委员会发布的公报说,法尔和梅洛获奖是因为他诺贝尔奖评审委员会发布的公报说,法尔和梅洛获奖是因为他 们们“发现了控制遗传信息流动的基本机制发现了控制遗传信息流动的基本机制”。公报指出,。公报指出,RNARNA干干 扰已被广泛用作研究基因功能的一种手段,并有望在未来帮助扰已被广泛用作研究基因功能的一种手段,并有望在未来帮助 科学家开发出治疗疾病的新疗法。科学家开发出治疗疾病的新疗法。梅洛(Craig Mello)生于1960 年,是被恐龙骨引入科学世界的 。梅洛童年时经常跟着父亲在美 国西部寻找化石。从那时起,他 就迷上了远古时代、
3、地球历史和 人类生命的起源等问题。高中时 代,梅洛的兴趣逐渐转移到了基 因工程方面。法尔(Andrew Fire)1959年出生 在美国加利福尼亚州,本科在加 利福尼亚大学伯克利分校主修数 学,仅用3年时间就拿到学位。 与梅洛类似,他逐渐对涉及生命 奥秘的遗传学产生兴趣,并将其 作为自己终身的学术追求。Small RNAs Make Big SplashScience Dec 20 2002: 2296- 2297. 基因沉默(gene silencing) 是指生物体中特定基因由于种种原因不 表达。基因沉默现象首先在转基因植物 中发现,接着和线虫、真菌、昆虫、原 生动物以及高等动物中陆续发现
4、。大量 的研究表明,环境因子、发育因子、DNA 甲基化、组蛋白修饰、基因拷贝数、位 置效应、生物的保护性限制修饰以及基 因的过度转录等都与基因沉默有关。 总的看来,基因沉默发 生在两种水平上,一种是由 于DNA甲基化、组蛋白修饰、 异染色质化以及位置效应等 引起的转录水平上的基因沉 默(transcriptional gene silencing,TGS),表现为 mRNA不能正常合成,造成基 因失活。另一种是转录后基因沉默 ( post-transcriptional gene silencing,PTGS),即在基因转录 后的水平上通过对靶标RNA进行特异 性降解而使基因失活。 基因沉默是
5、 基因表达调控的一种重要方式,是 生物体在基因调控水平上的一种自 我保护机制,在外源DNA侵入、病毒 侵染和DNA转座、重排中普遍存在。对基因沉默进行深入研究,可 帮助人们进一步揭示生物体基因遗 传表达调控的本质,在基因克服基 因沉默现象,从而使外源基因能更 好的按照人们的需要进行有效表达 ;利用基因沉默在基因治疗中有效 抑制有害基因的表达,达到治疗疾 病的目的,所以研究基因沉默具有 极其重要的理论和实践意义。其它RNA siRNA ( small interfering RNA ) shRNA ( short hairpin RNA ) stRNA ( small temporary RNA
6、 ) miRNA ( micro RNA ) snRNA ( small nuclear RNA ) dsRNA ( double-stranded RNA ) ncRNA ( non-coding RNA ) 一、RNA干扰的发现 94年Cogoni等证明真菌中 亦有类似现象,此称为基基 因压制因压制(quelling)。90年代初,美国和荷兰的两个转基 因植物实验组Rich Jorgensen和同 事,在对矮牵牛(petunias)进行的 研究中有个奇怪的发现:将一个能 产生色素的基因置于一个强启动子 后,导入矮脚牵牛中,试图加深花朵 的紫颜色,结果没看到期待中的深 紫色花朵,多数花成了花
7、斑的甚至 白的。也就是说转基因的植株不仅 没有新基因表达,反而使原有的色 素基因也受到了抑制,Jorgensen 将这种现象命名为共抑制共抑制 (cosuppression)一、RNA干扰的发现 1995年,康乃尔大学的Su Guo博士在 试图阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans) 的par-1基因时,发现了一个意想不到 的现象。她们本想利用反义RNA技术特 异性地阻断上述基因的表达,而同时 在对照实验中给线虫注射正义RNA以期 观察到基因表达的增强,但得到的结 果是二者都同样地切断了par-1基因的 表达途径。这是与传统上对反义RNA技 术的解释正好相反。该研究小组一直 未能给这个意外以合
8、理解释。 论文: Guo S, Kemphues KJ, Par L. Cell, 1995,81:611-620.一、RNA干扰的发现 1998年,华盛顿卡耐基研究院的Fire和麻省大学医学院的 Mello首次在秀丽新小杆线虫中证明上述现象属于转录后水平 的基因沉默基因沉默。他们发现Su Guo博士遇到的正义RNA抑制基因 表达的现象,以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断,都 是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链微量双链RNARNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现,基 因抑制效应变得十分微弱,而经过纯化的双链RNA却正好相反 ,能够高效特异性阻断相应基因的
9、表达,其抑制基因表达的效 率比纯化后的反义RNA至少高2个数量级。该小组将这一现象称 为RNA干扰。 论文: Fire A, Xu S, Montgomery ME, et al. Nature. 1998,391:806-811.(A)Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. (B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple stainin
10、g). (C) Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain mex-3 mRNA, although levels may be somewhat less than wild type. (D) Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3 ; no mex-3 RNA is detected. (Tem
11、plates used for interfering RNA and in situ probes were largely non-overlapping.) Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA. Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization of 4-cell stage embryos. RNAi 研 究 史20多年前,在对矮牵牛花(petunias)进行的研究中 发现协同抑制现象“cosuppression“,导入的基因和其相 似
12、的内源基因同时都被抑制。 96年前后,研究发现 注入反义RNA及正义链RNA都能 抑制线虫par-1 基因的表达;三年后,首次将双链RNA注入 到线虫中,结果表现出比单独注射正义链或者反义链都要强 得多的基因沉默效果,这种技术的成熟使得大规模筛选线虫 RNAi诱导的功能缺失突变体成为可能,并引发后继的大量 针对这种模式生物基因敲除的研究 。在果蝇的研究中同样发现RNAi。通过显微注射或者通 过基因枪将dsRNA注入果蝇胚胎中能够引发基因沉默。在 过去的几年中RNAi技术在果蝇的研究中成为一种反向遗传 工具,用于鉴定功能缺失表型。 2001年Elbashir等 Nature上首次报道通过21个核
13、苷 酸的siRNA成功地在哺乳动物培养细胞中诱导特异性基因沉 默。随后,在小鼠等多种细胞中也取得了成功。一、RNA干扰的发现 在1999年短短的一年间,发现RNA干扰现象广泛存在于从植物 、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到 人类的几乎所有的真核生物中细胞。2000年,又先后发现小 鼠早期胚胎中和大肠杆菌中也存在RNA干扰现象。2000年提出RNAi作用机制模型。论文: Hannond SM et al. Nature, 2000, 404(6775):293-296 Zamore PD. Cell, 2000,101(1):25-332001年,RNAi技术成功诱导培养的哺乳
14、动物细胞基因沉默现 象。Nature,2001,411(6836):494498 RNAi技术被Science评为2001年度的十大科技进展之一。发现Dicer酶2001年小RNA的研究有一个关键 的突破。冷泉港实验室的Gregory Hannon及其同事发现了Dicer酶。Dicer 酶能将长的双链RNA切割成小的双链RNA 。这些小的双链RNA属于microRNAs (miRNA)或small interfering RNAs (siRNA)。在RNAi中发挥作用的是siRNA ,而miRNA能抑制RNA翻译成蛋白质,下 次再讲miRNA 。一、RNA干扰的发现 2002年针对RNA的进一
15、步研 究表明,一些长度较短的小RNA , 能够对细胞和基因的很多行为进行 控制,如打开、关闭多种基因,降 解一些不需要的信使RNA。在植物中 它能够防止有害的基因或病毒基因 进入植物的基因组中,起到保卫基 因组的作用。小RNA在细胞分裂过程 中也能发挥重要的控制作用,可以 指导个体的发育和分化。 一、RNA干扰的发现 RNA干扰 ( RNA interference, RNAi ) 现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来 病毒侵犯的防御机制,是指内源性或外源性 与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列 的双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA) ,在细胞内特异地降
16、解该mRNA,从而致使特 异性的基因有效封闭的过程,是一种序列特 异性的转录后基因沉默 ( post- transcriptional gene silencing,PTGS)。 一、RNA干扰的发现 二、RNA干扰的机制 dsRNA:双链RNA,包含正义链和反义链 Dicer:属于RNase 家族,是dsRNA的特异性核酸内切酶 siRNA:small interfering RNA ,RNAi的关键效应分子,21- 23个nt大小的双链RNA RISC:RNA-inducing silencing complex,具有核酸内切、 外切以及解旋酶活性 RdRP:RNA-dependent RNA polymerases,依赖RNA的 RNA聚合酶,是RNAi的调节因子,使RNAi可以在生物体内传 递预备知识:基因沉默二、RNA干扰的机制 转录水平的基因沉默(Transcriptional Gene Silencing, TGS) 转录后水平的基因沉默(Pos