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1、在培养的大鼠血管平滑肌细胞中vaspin 通过抑制活性氧依赖的 NF-B和 PKC活性抑制TNF-a诱导的细胞内粘附分子 1作者：Sukanya Phalitakul, Muneyoshi Okada, Yukio Hara, Hideyuki Yamawaki杂志：Pharmacological Research摘要 vaspin是新近发现的一种具有胰岛素增敏作用的脂肪细胞因子。我们假设vaspin可能在血管炎症中发挥重要作用。为了证明假设，我们研究vaspin对TNF-a刺激血管平滑肌细胞（SMCs）作用，主要是炎症信号转到。血管平滑肌细胞来自雄性wistar大鼠腹膜的大动脉，用TNF-a
2、（5-10ng/ml,20分钟 -6小时）在缺少和有vaspin （1-300ng/ml,预处理 24小时）。做WB分析细胞信号。 ROS产物用荧光用二氯荧光素二醋酸盐标记。单独用Vaspin处理对血管平滑肌细胞形态学和细胞信号没有影响。Vaspin显著降低TNF-a诱导的单核细胞粘附到SMCs。Vaspin显著抑制TNF-a诱导的细胞内粘附分子-1（ICAM-1 ）蛋白的表达和 NF-KB和PKC磷酸化。NF-KB和PKC抑制剂显著减少TNF-a诱导的细胞内粘附分子-1（ICAM-1 ）表达。而且， vaspin抑制TNF-a诱导的ROS产生产物。一种抗氧化剂，N-乙酰-L-半胱氨酸阻止TN
3、F-a 诱导的 NF-KB和PKC的激活和ICAM-1表达。结果表明vaspin抑制TNF-a诱导的细胞内粘附分子-1（ICAM-1）表达通过阻止ROS产物和后面的NF-KB和PKC激活。因此，vaspin 可能对血管SMCs炎症状态有抑制作用。前言肥胖在全球范围内迅速增加，肥胖是引起健康问题的脂肪过度蓄积特点。另外，肥胖与低度炎症和脂肪组织来源的炎症分泌因子密切相关。而且，脂肪组织作为活跃的内分泌及旁分泌器官能分泌大量细胞因子，称作脂肪细胞因子。促炎因子包括TNF-a,IL-6,瘦素，PAI-1 和抵抗素等，而抗炎因子包括脂联素。Vaspin是从 OLET2型糖尿病肥胖大鼠体重和高胰岛素血症
4、达最高时内脏脂肪组织中分泌出的脂肪细胞因子，vaspin具有胰岛素增敏作用，与代谢紊乱相关。事实上，人脂肪组织vaspin mRNA表达与肥胖，糖代谢和胰岛素抵抗相关。炎症在早期动脉粥样硬化中发挥重要作用。炎症反应与循环白细胞和血管内皮细胞和血管平滑肌细胞相关。我们最近研究显示vaspin对内皮细胞炎症几乎没有作用。然而，vaspin对血管SMCs炎症仍未阐明。在这项研究探究vaspin 对血管平滑肌细胞炎症反应作用并探讨信号机制。材料与方法：2.1材料 ：重组人vaspin(PeproTech, Inc., Rocky Hill, NJ, USA)和内毒素水平0.1ng/ug用水重悬至浓度0
5、.2mg/ml;TNF-a(Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Switzerland)；PDTC，NAC;抗体如下：磷酸化-NF-KB P65(Ser536),IKB-a(Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, USA);a-平滑肌 action；内皮粘附分子 ICAM-12.1细胞培养：雄性wistar大鼠（0.2-0.4kg,5-10周），分离肠系膜主干动脉，vaspin (1 300 ng/ml, 24 h, n = 3), TNF- (5 ng/ml, 24 h,n = 3), PDTC (10 M, 30 h, n = 3)
6、, NAC (10 mM, 6.5 h in the presenceof TNF- , n = 7), and rottlerin (30 M, 6.5 h in the presenceof TNF-a, n = 8) had no significant cytotoxic effect on the SMCs.24小时单独vaspin作用对SMC形态学没有影响。2.3 WB：WB操作过程与之前研究方法一致。蛋白裂解用平滑肌裂解液。蛋白浓度用BCA试剂盒定量。SDS-PAGA分离蛋白，硝酸纤维膜转膜，磷酸化抗体用3%BSA 封闭，总抗体用0.5%牛奶封闭，一抗（1:500稀释）4，二抗（
7、1:10000稀释），EZ-ECL系统显色。蛋白表达用总蛋白或平滑肌actin表达确定。结果用CS analyzer3.0 软件分析。重复至少三次试验。2.4 细胞粘附分析：U937单核细胞系从RIKEN 细胞库获得，培养于1640培养基和5%FBS 中。血管平滑肌细胞培养于6 孔板，用vaspin（1-300ng/ml，24h）预处理，然后TNF-a（5ng/ml ，6h ）刺激。之后37血管平滑肌细胞与U937单核细胞共培养1小时。非贴壁细胞用 TBS吸弃，然后4% 多聚甲醛固定3710min.。随机选择3个视野在200倍显微镜下进行贴壁的U937 单核细胞计数，求平均值，进行4次独立实验
8、。2.5ROS产物测量 细胞内ROS产物用2,7-二氯荧光素双醋酸酯（(H2DCFDA, Invitrogen)。SMC用TNF-a（5ng/ml ，20 分钟）处理在缺少和存在vaspin（1-300ng/ml，预处理24 小时），SMC培养在H2DCFDA（10uM）3730分钟。荧光图像获取用荧光显微镜装有cooled CCD camera。荧光密度测量用Image J 软件实验结果：3.1Vaspin对TNF-a诱导的单核细胞粘附到SMC作用为了证明vaspin可能抑制细胞因子介导的单核细胞粘附至SMC，SMC用 vaspin预处理（1300 ng/ml, 24 h）在用 TNF-a刺
9、激之前(5 ng/ml, 6 h)，然后与单核细胞共培养1 小时。Vaspin浓度依赖性降低单核细胞粘附至SMC 的数量。Vaspin（300ng/ml）显著减少TNF-a诱导的单核细胞粘附， vaspin单独作用没有影响单核细胞的粘附。3.2Vaspin对TNF-a诱导的ICAM-1表达的作用接下来我们验证vaspin 是否能抑制TNF-a诱导的粘附分子（调节白血球粘附至SMC ）的表达。用vaspin预处理（1 300 ng/ml, 24 h）在用TNF-a 刺激之前(5 ng/ml, 6 h)抑制TNF-a诱导的ICAM-1表达。另外，我们确定vaspin 预处理浓度依赖性抑制高浓度TN
10、F-a诱导的ICAM-1表达。Vaspin 单独处理对ICAM-1表达没有影响。3.3Vaspin对TNF-a诱导的NF-KB的活化作用为了研究vaspin抑制TNF-a诱导的ICAM-1的上游机制，我们检测 vaspin对TNF-a诱导的NF-KB的活化作用。为此，我们用WB检测了NF-KB P65的磷酸化作用。在用 TNF-a刺激之前(5 ng/ml, 6 h) 用vaspin预处理（1300 ng/ml, 24 h）浓度依赖性抑制TNF-a诱导的 NF-KB磷酸化作用。相反，vaspin （ 1300 ng/ml, 24 h）预处理不能抑制TNF-a诱导的IKB-a的降低，表明vaspi
11、n的抑制作用是IKB-a依赖性的。Vaspin单独处理没有影响基础NF-KB磷酸化和IKB-a表达。3.4Vaspin对TNF-a诱导的PKC的活化作用PKC在调节NF-KB活化中发挥重要作用。在用TNF-a刺激之前(5 ng/ml, 6 h) 用vaspin 预处理（1 300 ng/ml, 24 h）浓度依赖性抑制TNF-a诱导的PKC磷酸化作用.单独 vaspin作用不影响PKC 磷酸。为了进一步证明 PKC是否调节TNF-a诱导的 NF-KB的活化作用，SMC在用TNF-a 刺激之前(5 ng/ml, 6 h)用新的PKC抑制剂Rottlerin(30uM, 30 min) 。然而，R
12、ottlerin预处理对NF-KB的活化没有作用，表明NF-KB和PKC信号通路是平行的。3.5Vaspin对TNF-a诱导的MAPK的活化作用在用TNF-a 刺激之前(5 ng/ml, 6 h) 用vaspin预处理（1300 ng/ml, 24 h）ERK ,JNK和P38 的磷酸化作用.单独 vaspin作用也不影响3.6NF-KB或新的PKC抑制剂对TNF-a诱导的 ICAM表达的影响NF-CKB抑制剂PDTC显著降低TNF-a诱导的 ICAM表达。而且，rottlerin预处理明显抑制TNF-a诱导的 ICAM表达。3.7Vaspin对TNF-a诱导的ROS产物的影响为了了解vasp
13、in抑制NF-KB和 PKC磷酸化得影响，我们用H2DCFDA荧光染色法检测ROS产物。单独 vaspin作用也不影响 ROS产物基础水平，在用TNF-a刺激之前(5 ng/ml, 6 h) 用vaspin预处理（1 300 ng/ml, 24 h）减少TNF-a诱导的免疫荧光强度的增加。统计学上， vaspin显著抑制TNF-a诱导的 ROS产物。我们确定低浓度vaspin （ 110 ng/ml, 24 h）预处理不影响TNF-a诱导的ROS产物。3.8抗氧化剂对TNF-a诱导的NF-KB、PKC及 ICAM-1表达的影响为了证明TNFa诱导ROS产物调节NF-KB和 PKC表达，我们用抗
14、氧化物NAC（10mM,30min）预处理SMC在用TNFa之前，NAC明显抑制TNF-a 诱导的NF-KB和PKC磷酸化 。抑制 TNF-a诱导的ICAM-1表达。讨论：Vaspin是一种新的脂肪细胞因子，主要在白色脂肪组织表达。Vaspin具有抗炎作用因为它具有抑制白色脂肪组织促炎因子抵抗素，瘦素，TNF-a 表达的作用。 FU等研究发现vaspin不能抑制TNF-a诱导的炎症在人脐带静脉内皮细胞。这项研究中我们研究vaspin对血管平滑肌细胞TNF-a诱导炎症的作用。我们第一时间表明vaspin能抑制TNF-a诱导的NF-KB和 PKC磷酸化。相应的vaspin减弱TNF-a诱导的单核细
15、胞粘附到 SMC。因为vspin能抑制TNF-a诱导 ROS产物，表明vaspin 抑制NF-KB和PKC 磷酸化和ICAM-1表达通过阻止ROS产物。在病人中血清vspin水平尚不清楚。之前报道肥胖2型糖尿病患者和PCOS患者血清vaspin 水平升高。另一方面，CAD 患者血清vaspin 降低。我们用1-300ng/ml vaspin 是根据之前的研究。我们发现1-300ng/ml vaspin明显抑制 NF-KB和 PKC激活和 ICAM的表达。这些研究表明高vaspin 水平可能缓解炎症减轻早期动脉硬化风险。激活的NF-KB来自异二聚体，通常包括2种蛋白P50 和 P65亚基。NF-
16、KB激活细胞中促炎因子TNF-a、IL6、IL8。尤其P65 亚基在许多炎症基因粘附分子、细胞因子、趋化因子等翻译中发挥重要作用。我们研究发现vaspin显著抑制NF-KB p65（ser536）的磷酸化。研究报道NF-KB 激活是蛋白酶体IKB-a和NF-KB 核易位调节的。我们研究表明，vaspin不能抑制IKB-a的降解，表明vaspin的抑制作用是IKB-a依赖性的。进一步研究表明vaspin在内皮细胞炎症通路是MAPK途径（影响炎症基因的表达）。我们发现vaspin不能抑制TNF-a诱导的MAPK 磷酸化。我们进一步研究NF-KB下游因子包括ICAM-1和单核细胞粘附因子。 Vaspin预处理明显抑制TNF-a诱导的ICAM-1表达，并阻止单核细胞粘附至血管平滑肌细胞。相应的，之前报道表明血管平滑肌细胞ICAM-1表达促进单核细胞聚集和炎症位点迁移。为了阐明NF-KB下激活和ICAM-1表达的作用，我们证明NF-KB抑制剂PDT
