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1、实验六 细菌生化试验及理化因素对微生物影响目的：1、通过实验加深对细菌鉴定的理解2、学会观察分析生化试验结果3、了解某些物理化学生物因素对微生物的影响内容1、七项细菌生化试验2、紫外线对微生物的影响3、染料（龙胆紫）对微生物生长的影响4、药物敏感实验 一、细菌生化试验微生物生化反应是微生物 分类鉴定中的重要依据之一。理论依据不同的细菌含有不同的分解代谢的酶具有不同的分解代谢途径对同一营养物质的分解代谢及其产物有所不同常见的生化反应对 含 氮 化 合 物 的 利 用吲哚试验硫化氢试验石蕊牛乳试验其 他 试 验对 含 碳 化 合 物 的 利 用糖醇发酵试验甲基红试验VP试验枸橼酸盐利用试验产氨试验
2、硝酸盐还原试验苯丙氨酸脱氨酶试验明胶液化试验过氧化氢酶试 验七项生化试验1）醇糖分解试验：不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，能利用或不能利用。能利用则产酸产气，或产酸不产气。接种待鉴定细菌的各种糖培养基（葡、乳、麦、甘 、蔗 ）产 酸 + 产酸产气无变化 产生气体葡萄糖 乳 糖 麦芽糖 甘露醇 蔗 糖现象及记录常用于肠道杆菌的鉴定 18-24h37培养大肠埃希菌：分解乳糖产酸产气；致病性肠道细菌：大多数不分解乳糖七项生化试验2) 吲哚（Indol）试验：某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰吲哚， 为红色化合物。色氨酸 吲哚 玫瑰吲哚吲哚试剂七项
3、生化试验3) MR （methyl red）试验：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，进一步分解可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基PH值下降至pH4.5以下。使甲基红指示剂变红。现象记录：加入试剂后呈鲜红色，记录为阳性“”； 弱阳性呈淡红色；阴性为黄色，记录为“”。 七项生化试验4) VP试验（Voges-Proskauer） ：某些分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，在空气中氧化为二乙酰,二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物。现象记录：加入VP试剂后能变成红色的，则为阳性“”，否则为阴性 “”。 葡萄糖发酵形成丙酮酸后的不同代谢 途径葡萄糖丙
4、酮酸大量混合酸pH降至4.4以下甲基红试剂培养基变红乙酰甲基甲醇二乙酰V-P试剂培养基变红脱酸七项生化试验5) 柠檬酸盐(citrate utilization)试验：细菌若能利用柠檬酸钠和磷酸铵作为生长所需的碳源和氮源，则利用柠檬酸钠产生碳酸 盐，利用铵盐产生的NH3反应，形成NH4OH，使培养基p升高，指示剂溴麝香草酚兰由绿变为深蓝色。现象记录：变深蓝色的菌株记录为阳性“”；未变色为阴性“”。IMViC试验用于肠道菌鉴定I - 吲哚（indol）试验M - 甲基红（methyl red）试验V - VP（Voges-Proskauer）试验C - 枸橼酸盐利用（citrate utiliz
5、ation）试验。IMViC试验七项生化试验6) 硫化氢试验：有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或铁盐可生成黑色沉淀物。现象记录：有黑色沉淀的记录为硫化氢试验阳性。 “”； 否则为阴性 “”。七项生化试验7) 触酶试验（过氧化氢酶试验）：检测细菌有无产生过氧化氢酶或过氧化物酶（触酶）。当加入过氧化氢液，菌株中产生气体。（H2O2的形成看作是糖需氧分解的氧化终末产物，因为过氧化氢的存在对细菌是有毒性的，细菌产生过氧化氢酶将H2O2分解 。现象记录：能产生气体的为阳性“” ，否则为阴性“”。 2、细菌生化试验的条件和试验时注意事项：1）纯培养物方可进行生化
6、试验2）接种时避免交叉污染3）标记必须准确4）试剂可用标准菌株作对照3、细菌生化鉴定的技术国内：杭州微生物试剂有限公司细菌生化鉴定编码管，产品鉴定范围涵盖几个科属的细菌。一株拟态弧菌的编码鉴定计数及菌名检索(示例)第1位数第2位数第3位数第4位数第5位数第6位数第7位数鉴鉴 定 结结 果 精 氨 酸赖赖 氨 酸鸟鸟 氨 酸柠柠 檬 酸硫 化 氢氢尿 酶 吲吲 哚哚 明 胶葡 萄 糖甘 梨 醇肌 醇山 梨 醇鼠 李 糖蔗 糖蜜 二 糖苦 杏 仁 甙甙阿 拉 伯 糖氧 化 酶反应结应结 果梅 氏 弧 菌应应得数 值值组组合编编 码码国外： 1）API细菌鉴定系统（梅里埃） API 鉴定产品包括试剂
7、条和数据库，试剂条通常包含20个微量生化试验。 目前 API系列 提供的16个产品鉴定范围涵盖几乎所有的细菌群，超过550个不同的种。 2）自动化细菌鉴定系统 （Biolog微生物自动分析系统） 该系统将细菌的生理生化过程的检测与先进的计算机管理手段有机结合起来，是一种专门用于细菌诊 断和鉴定的新型专家系统。 自动阅读待测细菌对各种碳源代谢情况的数据；自动输入计算机的有关数据库；自动完成数据库的检索，细菌鉴定，结果显示和结果打印等过程。 API 20E系统各种API条试验安排1、3、5、7组接种1号菌，以组为单位接种发放的生化微量管；标明组号和菌号。2、4、6、8组接种2号菌，以组为单位接种发
8、放的生化微量管；标明组号和菌号。观察记录结果时，相邻的组交换结果，写实验报告。24及48小时分别观察一次结果。二、理化因素对微生物的影 响环境因素如温度、紫外线等，某些化学药品及抗生素等对微生物的生长繁殖、生理生化过程产生影响，不良环境条件使微生物的生长受抑制或导致死亡。1、紫外线对微生物的影响作用于菌体DNA，使DNA分子结构破坏，影响DNA复制与转录时的正常碱基配对，引起致死性突变而死亡。265-266nm)将大肠杆菌、葡萄球菌分别接种于营养琼脂平板，用均匀划线涂布方法，然后将一张剪成中空的纸片遮盖于下半部平皿上，置于紫外灯下照射一定时间，取去纸片，盖上皿盖，放置37 培养48h观察结果。
9、（实验室紫外灯波长253.7nm）紫外线试验实验安排n培养皿从外面底部划分标记，一半接种金色葡萄球菌，另一半接种大肠杆菌。n1、 3 、 5 、 7 、 组照射20min 。n2 、 4 、 6 、 8组照射5min。贴标签后置37,48h培养。观察结果，相邻两组比较结果，出具试验报告2、染料（龙胆紫）对微生物生长的影响龙胆紫可改变细菌的氧化还原电位，破坏正常的离子交换，抑制酶活性。从而抑菌。不同的浓度，抑菌效果不同。用记号笔在龙胆紫培养皿外面底部从中划线，在划线的一边接种大肠杆菌，另一边接种葡萄球菌，标记后置37,48h培养。观察结果，出具实验报告。实验安排：n每组一个1/百万龙胆紫琼脂培养
10、基，分别接种大肠杆菌和葡萄球菌；（浅紫色）n每组一个1/十万龙胆紫琼脂培养基，分半接种大肠杆菌和葡萄球菌； （深紫色）3、药物敏感试验用大肠杆菌和葡萄球菌培养物分别均匀涂布营养琼脂培养皿，将提供的抗菌素纸药片贴于培养基表面。标记后置37,48h培养，观察结果，出具实验报告。药物敏感试验涂布接种细菌到 培养皿摆放选择的药敏纸片测量抑菌圈 记录分析结果37培养结果判定：根据药物纸片周围有无抑菌圈及其直径大小，来判断该菌对各种药物的敏感程度，分为高度敏感、中度敏感、低度敏感和不敏感四种。不同敏感程度在指导临床用药时可加剂量。实验安排n每组两个营养琼脂平皿，一个接种大肠杆菌，另一个接种葡萄球菌，均采用
11、均匀涂布的方式；n在涂菌的培养基上摆放提供的五种抗生素纸片，要求两药片间的距离两厘米以上。思考题1、芽孢的存在对消毒灭菌有什么影响？对处理有芽孢的致病菌有什么意义？2、在温度和时间相同时，为什么湿热灭菌比干热灭菌效果好？3、紫外线杀菌原理是什么？ n%+7RtH#MD+BJYLF9V8FM(!+VUyr+YtgUHd3NHnpeqpMZqSBab5rHhVVQ8wi3lDl4nHukN9ag$K- uyKvq*L2FVdjEDSNYR!T&Z43ouW2F*Lga*7bG&Mntt#i7%ewe*dve0oPKJcV0ahgI#z+XACrEDY&lx$6CRdpS#egvpuc6KpOcjx
12、kdWh6!8l*DKPjX$+GhuKvkOekyibN8Ytn6c6npOXhv!7FUgtV%kk6fcxH6wbSRI$5Mebs3R)g0U5q9$8l*BD+ImI12b%Vn+nX063W#OXPZT&W&QM%(lx(j(xo5ii#G$kim%ETyP&HlzNtauOY%tYNvHKt6t#)gag+zZ+vKas%cWF8*DxdfrdbVE)AXENPbAl1jbF211Bxxy1GO#6Rmld1Zl!6wwX+ktWy+Qd$pr%bJWef*+#5m$J+yFP%1C-HUBlH(NWv5f5rKq3olXwLyDAZw!yP9h- 1#1Doq8nFDTOKUQ
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