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1、生物技术综合实验Comprehensive experiments of biotechnology 主要内容 Contents：一、课程简介 核酸的分离与纯化 Isolation and Purification of Nucleic Acid 二、电泳技术 Agarose Gel Elrctrophoresis and SDS-PAGE 三、聚合酶链式反应技术 Polymerase Chain Reaction 四、DNA序列测定 DNA Sequencing 五、分子杂交技术 Molecular Hybridization Southern,Northern and Western Bl
2、ot 六、基因文库和cDNA文库的构建 Construction of cDNA Library and DNA Library 七、外源基因的克隆与表达 Heterogenic Gene Cloning and Expression 八、蛋白质的分离、纯化技术 Isolation and Purification of Protein1 表达蛋白质的分离沉淀蛋白质分离收集菌体 洗涤破碎细胞等电沉淀 盐析沉淀 高分子物 质分级沉淀超声破碎 化学法 溶菌酶上清液培养基1.1 凝胶过滤层析w凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝 胶小球具有网状结构，小分子物质能进 入其内部，而大分子物质却被排除在外
3、部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱 时，溶液中的物质就按不同分子量筛分 开了。 凝胶过滤层析柱胶球大小-介质离子粗细影响流动w(1) 胶球颗粒有一定大小，一般可分为 corse, medium, fine, super fine 四种粗细 (grade)；越粗的胶体，流率越好，但分 辨率越差。 因胶球外面的缓冲液是由胶球表面向内扩散， 样本蛋白质也是以扩散方式进入胶球，再由中心向外扩散 出来。胶球半径越大，扩散距离越大，效果越差。 w(2) 下图说明这种扩散介质的机制。 而近年来因材料科学的 进步，发展出通透性特强的胶球，缓冲液可直接浸润而进 入胶球，不需经过扩散作用，是为dispersion
4、弥散式的胶体 ，效果较好且快速。商品化称为 perfusion chromatography 。 胶球大小-介质离子粗细影响流动二、 离子交换层析 w离子交换层析是在以离子交换剂为固定相 ，液体为流动相的系统中进行的。离子交 换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的 。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合 物的反应主要以离子交换方式进行，或借 助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或 离子化合物的吸附作用进行。两大类离子交换介质w由介质带电基团的不同，可分为两大类： w介质带电基团(counter ion) (1) 阳离子交换介质 (cation exchanger)：载体-阴离子基团 . 阳离子 (2
5、) 阴离子交换介质 (anion exchanger)：载体-阳离子基团 . 阴离子 阳离子： 两价阳离子 NH4+ K+ Na+ H+ Li+ 阴离子： I - Br - Cl - HCO3- CH3COO-, OH- 四、 亲和层析 w亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激 素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类 似，每对反应物之间都有一定的亲和力。在亲 和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分 子之间具有亲和力，并产生复合物。 w实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L（对 酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等） 以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M （如活化琼脂糖等）上，制成亲
6、和吸附剂ML ，或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持 束缚特异物质的能力。特异性配体亲和层析法与通用性配 体亲和层析法w特异性配体亲和层析法：配体一般为复杂的生 命大分子物质（如抗体、受体和酶的类似底物 等），它具有较强的吸附选择性和较大的结合 力。 w通用性配体亲和层析法：配体则一般为简单的 小分子物质（如金属、染料，以及氨基酸等） ，它成本低廉、具有较高的吸附容量，通过改 善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。金属螯合亲和层析wa. 许多蛋白分子上带有金属离子，则此蛋白质可 能会吸附该金属。 wb. 若把某金属固定到固相载体上，则此载体将会 专一性地吸附需要此金属的蛋白质。 wc. 基因操
7、作时，经常在表达蛋白质的末端加上一 段含有六个 His 的片段；则此表达蛋白质，可以 吸附到含有镍的吸著剂上，可以用咪唑流洗出来 。 wd. 这种载体上结合有某些可与金属产生配位键 的基团 (如 nitrilotriacetic acid)，这些基团与金 属离子结合 (如镍离子)后，即可成为亲和吸附剂 。疏水性层析法w(1) 蛋白质分子表面有部份疏水性区域，若在一极 性很强的环境中，则会被吸附在非极性的固定相载 体上；若环境的极性降低，则可被洗脱出来，即为 疏水性层析法 (hydrophobic interaction chromatography, HIC)。 w(2) HIC 没有亲和层析
8、析法那么强的专一性，较似 离子交换法，但所根据的作用力，则是非极性基团 间的疏水性引力。 反相层析法w(1) 是 HIC 及离子交换法的综合体，但属于一种 partition 层析；可使用离子交换 (或类似 HIC) 的介质。 w(2) 混合极性及非极性溶液为流动相，当流动相 通入介质后，介质表面可固定其中的极性溶液 ( 若使用 HIC 介质则固定非极性者)，样本分子会 在此二相中进行 partition 分离。 w(3) 因固定相及流动相的极性刚好相反，故名 reverse phase。离子交换层析树脂材质 w疏水性：聚苯乙烯-苯二乙烯 w亲水性：纤维素（cellulose）、葡聚糖凝 胶（
9、Sephadex gel）和琼脂糖凝胶（ Sepharose）特性是具有亲水性和较大的表面积，对生 物活性物质而言，是一个较为温和的环境 ，同時也是大分子所适用的分离纯化材质 离子交换剂的选择 w保持欲分离物质的生物活性。 w已知等电点的物质，在高於等电点的pH条 件下，因帶有负电荷，应采用阴离子子交 換，在低於等电点的pH下，則采用阳离子 交換。 w未知等電點的物質，在一定pH條件下進行 電泳，向陽極移動較快的物質，在同樣條 件下可被陰離子交換劑吸附，向陰極移動 較快的物質可被陽離子交換劑吸附。緩衝液的選擇w緩衝液離子以不干擾分離物活性測定、不影響待 測物溶解度、不發生沉澱為原則； w使用陰
10、離子交換纖維時要選用低於交換劑離子 pK值的緩衝液，若欲分離的物質屬於酸性，則緩 衝液的pH值要高於該物的等电点；用陽離子交 換纖維時要選用高於 pK值的緩衝液，目的物屬 於鹼性物質的話，緩衝液要低於該物等電點的 pH值。所使用的緩衝液 pH 只要比樣本蛋白質的 pI 稍高或低 1 pH 單位即可 。Donnan Effect 與 pH 變化離子交換介質表面的 微環境 會比緩衝液高或低一個 pH 單位。離子交換樹脂的前處理 w離子交換樹脂使用前，先以蒸餾水除去 其內之雜質 ，並以NaOH和HCl處理樹脂 ，使其上的官能基完全露出。 w再以水清洗至pH 7.0，最後用欲使用的 緩衝液浸泡。w(1
11、) 離子交換介質與蛋白質的結合量有一定 限度，稱為該交換介質的 容量 (capacity) ；若超過此一容量，多出的樣本會直接流 出。 w(2) 交換介質的結合容量大小，受層析條件 不同、蛋白質種類不同、緩衝液不同、pH 或離子濃度不同等，有很大的差異。 如 DEAE-Sepharose CL-6B 每 100 mL 可結合 11 克白蛋白，但對 ferritin 只有 0.4 克。介質容量有限 w可用 pH 或 盐 梯度 w洗脱方式有： 连续梯度 (continuous gradient) 及 阶段 梯度 (stepwise gradient)。洗脱离子交换法操作要点w1胶体平衡：用过的胶体
12、要再生完全平衡 在缓冲液中； w2洗脱方式：通常都以氯化钠进行连续梯 度洗脱； w3浓度体积：高低限洗脱液的浓度及体积离子交换层析的应用w制备、纯化生命物质 w测定蛋白质等电点凝胶过滤层析凝胶的分类w1）葡聚糖凝胶 w2）琼脂糖凝胶 w3）聚丙烯酰胺凝胶凝胶过滤法的应用w脱盐和浓缩 w分离生命物质 w去热源物质（糖蛋白） w测定分子量亲和层析亲和层析法基质的选择 w理想基质： 1）极低的非特异吸附性； 2）高度亲水性 3）较好的理化稳定性 4）具有大量化学基团，能有效活化，易和配 体结合； 5）具有适当的多孔性纤维素、聚丙烯酰胺、交联葡聚糖、琼 脂糖、交联琼脂糖、多孔性玻璃珠；用在蛋白質，仍以
13、 聚糖類 為最佳。 以 Sepharose為例，可自行用 CNBr 活化，使糖 分子接上 -O-CN (cyanate ester) 基，再與配 体上的胺基反應。 有些親和層析法使用 spacer arm 來降低 配体的立体障礙影响亲和层析的因素w样品体积和流速 w温度親和層析法的應用 w1. 核酸的純化： w單股DNA與纖維素（cellulose）組合的凝膠，已 成為分離mRNA的重要方法之一 w將單股DNA接在Sepharose上，純化DNA聚合酶 或RNA聚合酶。 w2. 激素受體（receptor）的純化 w3. 抗體與抗原的純化 w4. 酶和酶的抑制劑純化液相柱层析总结介質粒子越細，色析法的 解析力 就越佳，但流動相的流速也就越慢。流速太 慢反而 會導致 解析力 變差。
