多位点序列分型

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1、多位点序列分型 Multilocus Sequencing Typing MLST陈智瑾四川大学华西公共卫生学院Contents两种分型方法的比较MLST的步骤MLST的方案设计MLST的由来实例分析多位点酶电泳（Multilocus enzyme electrophoresis,MLEE）根据酶的电泳迁移率的不同来描述变异选定 管家酶淀粉 胶检测不同电泳迁移速率 电泳谱等位基因 的变异性揭示微生物 基因多样性MLEE的缺点不能推断特殊位点的碱基序列不同实验室间的分型结果不能进行比较MLST的首次使用MLST是由多位点酶电泳(MLEE)衍生出来的一种分型方法在1998年,Maiden等首次将M

2、LST应用于脑膜炎奈瑟菌分型多位点序列分型 （MLST）一种基于核酸序列测定的细菌分型方法通过PCR扩增多个管家基因内部片段测定其序列，分析菌株的变异MLST的原理MLST方法一般测定610个管家基因内部 400600bp的核苷酸序列，每个位点的序 列根据其发现的时间顺序赋予一个等位基 因编号，每一株菌的等位基因编号按照指 定的顺序排列就是它的等位基因谱 ，也即 是这株菌的序列型（sequence type,ST ）。这样得到的每个ST均代表一组单独的 核苷酸序列信息 。序列型（ST）序列型（ Sequence-typying, STs ）等同 于MLEE得出的电泳型(Electrophore

3、tic type, ET）通过比较ST可以发现菌株的相关性,即密切 相关菌株具有相同的ST或仅有极个别基因 位点不同的ST,而不相关菌株的ST至少有3 个或3个以上基因位点不同MLST分析方法MLST技术针对看家基因设计引物对其进行 PCR扩增和测序,得出每个菌株各个位点的 等位基因数值,然后进行等位基因图谱(allelic profile)或序 列类型(sequence types, STs)鉴定，再根据等位基因图谱使用配对差异矩阵 (matrix pair-wise differences)等方法构建 系统树图进行聚类分析。MLST方案的设计三要素：选择经过初步筛选的菌株选择具有独特特征的

4、基因位点设计用于基因扩增和序列测定的引物1. 菌株的选择根据已有的分型方法和流行病学资料，选 择100株左右具有代表性的菌株作为分析对 象。理论上，这些选定的菌株要代表所研究细 菌的群体，而不是仅仅包含那些对人致病 的克隆。收集的菌株最好具有代表性，不仅仅由一 个亚型组成。2.管家基因的确定全基因组序列的测定大大方便MLST位点的 选择一般选择10到20株菌评价10至15个备 选位点。最终采用 7个位点进行后续实验和分析。 如果需要提高分辨力，可以加入个别非保 守的基因，例如表面抗原基因或者毒力基 因，这样比增加管家基因的个数将更有效3.引物的设计目的片段长度：400600bp所有引物调整为同

5、一退火温度， 以适用于大范围流行病学监测和群体研究为了发现引物结合位点可能存在的变异， 每个位点都应该设计一对以上引物http:/pubmlst.org/实际运用中，对于已有的成熟MLST方案的细菌，可直接从MLST数据库中获取方案。http:/pubmlst.org/MLST的步骤（二） 核酸序列信息的获取收集 病原 微生 物标标 本基因 组组 DNA 的获获 取PCR 扩扩增 目的 基因 片段目的 片段 的核 酸序 列测测 定整合 核酸 序列 信息MLST的步骤（三）结果分析结果分析根据分析的细菌群体组成1.以等位基因编号和ST编号为基本分析单 位提交到MLST分析网络服务器（www.ml

6、st. net） START和eBURST 2.直接分析核苷酸序列上传到GenBank比对服务器进行BLAST比对验证数据分析得到 等位基因图谱图谱新的STs则则找 出对应对应 的 clonal complex在数据库库中 找出相应应的 STs群体进进化研究分子流行病学 研究菌群结结构 调查调查菌群遗传遗传 学分析疾病的全 球性监监控鉴鉴定暴发发 性疾病的 病原体MLST结果分析流程图ST和克隆型遗传学上具有相关性但并不相同的细菌的集合,被称为是同源复合体(The clonal complex),也叫克隆型。以其核心的基因型来命名。MLST和PFGE的比较 两种不同的分子分型技术不同分子分型方

7、法比较分型方法分型力可分辨率可重复性结结果易解 释释性易操作性费费用RAPD较较好较较高一般一般简简便低PCR- RFLP好一般一般一般简简便低AFLP较较好高一般好简简便中MLST较较好较较高好好简简便较较高PFGE好高好好复杂杂较较高MLVA很好高好好简简便高MLST和PFGE的比较 两种不同的分子分型技术脉冲场凝胶电泳（PFGE）比较所确定的高度变异片 段高分辨力不适于进行全面的流行病 学调查及生物进化分析不同实验间重复性较差标准化技术数据库多位点序列分型（MLST）比较进化较慢的位点标准化技术数据库不同实验室间重复性好不适用于同血清型菌株间 比较MLST实例分析1.MLST方案（同MLST Database）2.核酸序列信息的获取2.1样本来源 54株结肠弯曲菌(C.coli)分离于2002年零 售禽肉中，均为不重复菌株 2.2PCR扩增 2.3测序3.结果分析3.1.MLST数据提交将测序序列在线递交至弯曲菌MLST数据库 ()进行分析,得出等位基因 型、序列型以及序列型克隆系。3.2UPGMA分析ST序列型的发育 树谢谢！