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1、 11 引言引言葡萄糖是人体中最基本的代谢物质之一,是机体能量的主要来源。进入循环系统与血液结合的葡萄糖称为血糖,血糖水平变化常可反映糖在体内代谢的状况。血糖含量过高，会导致糖尿病，并伴有感染心脏病、中风、肾虚、神经紊乱等疾病的危险1。测定葡萄糖的方法包括分光光度法2，电流测定法3,4,5、高效液相色谱法6、毛细管电泳法7及电化学方法等。其中，电化学生物传感器具有较高灵敏度及操作简单，又不会或很少损伤样品及造成污染等优点8，在葡萄糖定量检测方面显示出独特的优势。目前，利用无机纳米材料与生物有机分子复合物制备生物传感器备受关注，而电化学葡萄糖传感器更是研究热点之一。目前葡萄糖生物传感器多采用在电
2、极表面修饰葡萄糖氧化酶（GOD）,将 GOD 固定在具有生物相容性的电极界面通常可实现 FADH2与电极之间的直接电子传递，从而不需要向分析液中添加电子传递媒介体而对底物分子进行电化学测定。然而，GOD 最外层覆盖了糖链,而其与葡萄糖结合的活性位点在 FAD上面,处于较深的立体结构中。如果 GOD 与裸露的电极表面直接接触通常会引起蛋白质的结构变化，从而导致了蛋白质内部活性位点和电极之间的电子迁移非常困难9,10。研究表明，将 GOD 与无机纳米材料结合形成复合物有可能改善电极的直接电化学性能及响应灵敏度。无机材料通常具有良好的生物相容性，非常有利于所结合生物分子的活性保持。此外，无机材料还具
3、有较高的机械强度和热稳定性，也有利于保护固定在其中的生物分子免受极端环境条件的影响和破坏。再者，具有纳米尺寸的无机材料，通常可改善 GOD 电活性中心与基底电极间的电子传递。这其中，无机层状化合物具有明确规整的层状结构以及可以任意调节的层间距，对于容纳各种尺寸的生物分子更为容易11。目前，羟基磷灰石12、碳纳米管13,14,15、磁性物质16、壳聚糖17,18,19,20、石墨烯21,22、纳米金20等物质都已广泛运用于电化学传感器构建，而氨丙基功能化的镁页硅酸盐（AMP）还极少报道。以硅酸镁为基本结构的无机层状粘土，是活性生物分子的天然储库，被广泛应用于药物释放、生物催化剂制备等领域。如果对
4、其进行有机功能化修饰，特别是引入氨基基团，获得具有有机无机杂化结构的层状化合物，将可调控生物分子与其的结合方式和亲和力，改善固载能2力和酶活性23。此外，以简单滴涂方式形成的修饰电极稳定性通常较差，表面的复合物易在实验过程中脱落而导致实验结果的不可靠，因此，为保持修饰电极的稳定性，通常利用全氟化树脂（nafion）将复合物固定在玻碳电极表面24。同时，nafion膜是一种选择性渗透膜，可以消除或减少人体血清中其他还原物质诸如抗坏血酸、脲酸以及尿素等电活性共存物质对电化学过程的干扰25。基于以上背景，本文拟通过将葡萄糖氧化酶固定于 AMP 纳米层片中并修饰至玻碳电极表面，结合 nafion 膜的
5、加固效应，以期构建一种基于GOD/AMP/nafion 多层膜的生物电化学界面，从而实现 GOD 在玻碳电极上的直接电子传递能力及对溶解氧的灵敏电化学催化响应，从而建立测定葡萄糖的新方法。实验结果表明，该 GOD/AMP/nafion 多层膜修饰电极具有良好的直接电子传递能力，电子传递速率常数 Ks为 6.11 s1，对葡萄糖的线性响应范围为110-41.110-3 mol/L（R = 0.9999，n =12） ，检出下限为 3.1610-5 mol/L。利用该复合膜修饰电极检测了血糖实际样品，不受共存脲酸、尿素、Vc 等物质的干扰。2 实验部分实验部分2.1 仪器与试剂仪器与试剂2.1.1
6、 仪器仪器CHI660E 型电化学工作站；Nicolet-avater-370 傅里叶红外光谱仪；RJ-TGL-16G 型高速离心机（无锡市瑞江分析仪器有限公司） ；PHS-3C 型精密 PH计（上海雷磁仪器厂） ；HK2200 型超声仪（上海汉克科学仪器有限公司） ；BYT-120A 型石英亚沸高纯水蒸馏器（江苏白塔石英蒸馏器厂） ；ADVENTURER AR224CN 型电子天平（奥豪斯仪器上海有限公司） 。2.1.2 试剂和材料试剂和材料3葡萄糖氧化酶（GOD）、全氟离子树脂（nafion）均从 sigma 公司购买；六水合氯化镁、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、尿素、脲酸、抗坏血酸(Vc)、
7、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、邻苯二甲酸氢钾、铁氰化钾、硝酸钾、氢氧化钠、冰醋酸、乙醇均为分析纯；实验用水为二次去离子水。2.2 实验方法实验方法2.2.1 溶液的配制溶液的配制（1） 铁氰化钾-硝酸钾混合溶液（K3Fe(CN)6-KNO3）：0.001 mol/L + 0.2 mol/L；（2）磷酸氢二钠（Na2HPO4）：0.1 mol/L；（3）磷酸二氢钾（KH2PO4）：0.1 mol/L；（4）氢氧化钠（NaOH）：1 mol/L； （5）PBS（pH 7.00） 、PBS (pH 6.02)、PBS (pH 7.92)缓冲溶液由 0.1 mol/L KH2PO4与 0.1 mol/L N
8、a2HPO4按一定的体积比混合而得；（6）将葡萄糖氧化酶（GOD）加入到已制好的 0.1 mol/L pH= 7 的磷酸钠缓冲溶液中，制成 10 mg ml-1的贮备溶液。（7）200 mmol/L、40 mmol/L 抗坏血酸（Vc）用二次水配置而成。（8）50 mmol/L、10 mmol/L 脲酸（Uric acid）：用 1mol/L NaOH 配置而成。（9）0.1 mol/L 尿素用二次水配置而成。2.2.2 氨丙基功能化的镁页硅酸盐（氨丙基功能化的镁页硅酸盐（AMP）的合成及剥离）的合成及剥离六水合氯化镁 0.84g 溶解于20g 的乙醇中。将1.3mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷
9、逐滴地加入此溶液中，并不断搅拌。5分钟后，将所得的悬浊液快速搅拌过夜，然后装于8个4mL 的离心塑料管中离心分离，再向每个离心管中加入3mL 乙醇洗涤沉淀3次，然后所得样品在40下干燥。AMP 黏土的剥离是用2mL 蒸馏水把20mg 的黏土分散，然后在超声波浴中超声分散10分钟，得到透明悬浮液。42.2.3 GOD/AMP 复合物的制备复合物的制备在 1.0 mL 10 mg/mL AMP 剥离悬浮液中加入 10mg 葡萄糖氧化酶（GOD） ，震荡摇匀后，放置于冰箱中待用。2.2.4 生物传感器构建生物传感器构建玻碳电极准备：将玻碳电极用 1.0 m 的氧化铝粉打磨，然后将电极放在装有铁氰化钾
10、硝酸钾溶液的电解池中，测试工作电极的循环伏安曲线，直至氧化峰与还原峰电位差小于 80 mV 时电极打磨完成。打磨完毕后用去离子水洗净，最后电极表面有高纯度氮气吹扫干燥。GOD/AMP/nafion 玻碳电极修饰：GOD/AMP 复合物的溶液在电极修饰前，振荡摇匀 5 分钟，然后取 5 L 该悬浮液滴涂在玻碳电极表面，室温条件下干燥，然后再取 5 L 0.5% nafion 溶液滴涂在以上 GOD/AMP 修饰的电极表面，室温条件下干燥待用。2.2.5 表征和测试表征和测试AMP 的红外表征在 Nicolet-avater-370 傅里叶红外光谱仪上完成。电化学实验在 CHI660E 型电化学工
11、作站上完成。所有的实验都在一个典型的三电极系统中进行，其中修饰过的玻碳电极为工作电极、铂丝电极为对电极、饱和甘汞电极为参比电极。在测循环伏安图时，实验测试前，用高纯氮吹扫缓冲溶液 35 分钟，以除尽溶解于溶液中的氧，同时，实验过程中，为了保持一个无氧环境，继续用高纯氮在溶液表面吹扫，以彻底消除溶解氧对实验的干扰。待曲线稳定后，更改扫描速率从 50 mV/s 至 500 mV/s，每隔 50 mV/s 扫描一次。测完了无氧条件下的循环伏安图，以每隔 5 分钟的时间搅拌一次以溶解氧至电解质溶液中，然后测定循环伏安图直到信号稳定不变为止。再往溶液里加40 mmol/L 葡萄糖溶液，每加 10L 扫描
12、一次，电位扫描速率为 100mV/s。用计时电流法测定 PBS 缓冲溶液中葡萄糖溶度时，取 pH = 7 的 PBS 缓冲溶液 4.0 mL，加入磁搅拌子不断搅拌，设置运行时间为 2000s。在 200s 时开始每隔 50s 加入 40 mmol/L 的葡萄糖 35 次。5用循环伏安法测定电极对尿素、脲酸、Vc 的干扰选择性时，在电解池中加入磁搅拌子，搅拌使溶液溶解氧，然后停下测其循环伏安图直到信号稳定不变为止。向溶液中逐次加 0.1 mol/L 尿素 50 L、10 mmol/L 脲酸 40L、40 mmol/L Vc 40 L，每加 10 L 扫描一次，扫描速率为 100 mV/s。对实际
13、样品血糖含量测定时，在电解池中加入磁搅拌子，待溶液中的氧气饱和后，向溶液中加 40 mmol/L 葡萄糖溶液，每加 10 l 扫描一次，共加入 40 L。再向溶液中加入实际样品，每加入 50 L 扫描一次，共加入 150 L，扫描速率为 100mV/s。3 结果和讨论结果和讨论3.1 AMP 材料的表征结果材料的表征结果图 1 显示了在 40干燥数天之后得到的氨丙基功能化的镁页硅酸盐（AMP）的红外光谱图。从图中我们可以看出，在 3442 cm-1处有一个氨基的N-H 伸缩振动吸收峰，而在 2800 cm-1处则有-CH2-伸缩振动吸收峰，1147 cm-1为 Si-C 的单键伸缩振动，102
14、5 cm-1为 Si-O-Si 的单键伸缩振动，561 cm-1为Mg-O 的单键伸缩振动区，这表明所得的样品已经实现了氨丙基功能化。图 1 氨丙基功能化的镁页硅酸盐的红外光谱图3.2 GOD/AMP/nafion 修饰电极的电化学性质修饰电极的电化学性质3.2.1 GOD/AMP/nafion 修饰电极的直接电化学性质修饰电极的直接电化学性质560.74938.821024.701146.891225.691384.281506.341624.333045.893442.1120253035404550556065%Transmittance500 1000 1500 2000 2500 3
15、000 3500 4000 Wavenum bers (cm -1)6图 2 显示了不同电极在 0.1 mol/L 磷酸缓冲溶液（PBS，pH 7.0）中的循环伏安曲线。对于用 GOD 贮备溶液修饰并用 nafion 膜加固的玻碳电极，氧化还原峰分别在392mV 及340mV 出现，氧化还原峰电位差（Ep）为 52mV。然而，当玻碳电极用 GOD/AMP 复合物悬浮液修饰并用 nafion 膜加固后，一对更为明显的可逆氧化还原峰分别在450 及410mV 出现，其表观峰电位（Ep）为430mV，氧化还原峰电位差（Ep）为 40mV。这一实验结果提供了明显的证据，表明将 GOD 固定于 AMP
16、纳米层片中，可显著增强 GOD 在玻碳电极上的直接电化学性能，提供了一种构建非媒介体电化学传感器的简便方法。0.20.0-0.2-0.4-0.6-0.8-1.0456789GODGOD/AMPI / AE / V vs.SCE图2 GOD/nafion及GOD/AMP/nafion修饰电极的循环伏安曲线图，扫描速率为100 mV/s如图 3 所示，将 GOD/AMP/nafion 薄膜修饰的玻碳电极置于 pH 为 7.0 的PBS 溶液中，在-1.0 0.2 V 范围内，以 100 mV/s 的扫描速率连续进行 20 次循环伏安扫描，除第一次循环因电解质溶液中还残留有少量氧导致还原峰电流略大外，其余多次循环扫描的氧化还原峰，无论峰电流还是峰电位几乎没有明显变化。说明 GOD/AMP/nafion 薄膜修饰的电极具有良好的稳定性。70.20.0-0.2-0.4-0.6-0.8-1.059606162636465I /
