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1、您 的 创 新 药 物 研 发 伙 伴HPLC及MS原理和使用作者 卜宗磊 孙萌目 录2您 的 创 新 药 物 研 发 伙 伴液相色谱理论发展简况1HPLC的基本概念和理论2HPLC系统345仪器的维护以及故障的排除6有机质谱分析原理及基础知识液相色谱理论发展简况v 色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分 经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸 附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在 固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为 色层法、层析法。 v 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在190
2、6年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法 ，HSLP)。也称现代液相色谱。3您 的 创 新 药 物 研 发 伙 伴液相色谱理论发展简况v 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下 用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低 、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱 法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展 起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗
3、粒小而均匀， 小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相 ，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色 谱法(High Speed Liquid Chromatography4您 的 创 新 药 物 研 发 伙 伴HPLC的特点v 高压-压力可达150300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2 以上。 v 高速-流速为0.110.0 ml/min。 v 高效-可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100 种。 v 高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品
4、少。5您 的 创 新 药 物 研 发 伙 伴HPLC的优点HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：v 速度快-通常分析一个样品在1530 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。 v 分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 v 灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达 0.1pg。 v 柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。 样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集 单一组分或做制备。6您 的 创 新 药 物 研 发 伙 伴高效液相色谱分离原理高效液相色谱法按分离机制的不同分为v 液固吸附色谱法v 液液分配色谱法（正相与反相） v 离子
5、交换色谱法 v 离子对色谱法 v 分子排阻色谱法7您 的 创 新 药 物 研 发 伙 伴高效液相色谱分离原理v 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法 (NPC)和反相色谱法(RPC)。8您 的 创 新 药 物 研 发 伙 伴液液色谱法正相色谱法（ NPC）反相色谱法（ RPC）高效液相色谱分离原理正相色谱法 v 采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相 为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常 加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保 留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、 胺类、羰基类及氨基酸类等）9您 的 创 新 药
6、物 研 发 伙 伴高效液相色谱分离原理反相色谱法 v 一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液 ，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶 的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱 的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计， 它占整个HPLC应用的80%左右。 v 随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大 ，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样 品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需 要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.57.5（28），太 高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落
7、。 有报告新商品柱可在pH 1.510范围操作。10您 的 创 新 药 物 研 发 伙 伴HPLC的基本概念和理论v 色谱图(chromatogram)-样品流经色谱柱和检测器，所得到的 信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。 v 基线(base line)-经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。v 噪音(noise)-基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过 载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 v 漂移(drift)-基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电 压、温度、流动相及流量的不稳定所引
8、起，柱内的污染物或 固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。11您 的 创 新 药 物 研 发 伙 伴HPLC的基本概念和理论v 色谱峰(peak)-组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线 。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分 布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰 (leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。 v 拖尾因子(tailing factor，T)，用以衡量色谱峰的对称性。也称 为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor) 。中国药典规定T应为0.951.05。T0.95为
9、前延峰，T 1.05为拖尾峰。T=b/a12您 的 创 新 药 物 研 发 伙 伴HPLC的基本概念和理论v 峰底-基线上峰的起点至终点的距离。 v 峰高(peak height，h)-峰的最高点至峰底的距离。 v 峰宽（peak width，W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的 两个交点间的距离。W4 v 半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽 。Wh/22.355 v 标准偏差（standard deviation，)-正态分布曲线x1时（拐 点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏 差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的
10、分散程度。小， 分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，大， 峰形胖、柱效低。 v 峰面积(peak area，A)-峰与峰底所包围的面积。13您 的 创 新 药 物 研 发 伙 伴HPLC的基本概念和理论14您 的 创 新 药 物 研 发 伙 伴HPLC的基本概念和理论v 死时间(dead time，t0)-不保留组分的保留时间。即流动相（ 溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测 定死时间。 v 死体积(dead volume，V0)-由进样器进样口到检测器流动池 未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管 路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）
11、、柱出 口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡 过程，其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分 体积应尽量减小。V0Ft0（F为流速）15您 的 创 新 药 物 研 发 伙 伴HPLC的基本概念和理论v 保留时间(retention time，tR)-从进样开始到某个组分在柱后 出现浓度极大值的时间。 保留体积(retention volume，VR)-从进样开始到某组分在柱后 出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR FtR v 调整保留时间(adjusted retention time，tR)-扣除死时间后的 保留时间。也称折合保留时间(reduced
12、retention time)。在实 验条件（温度、固定相等）一定时，tR只决定于组分的性质 ，因此，tR（或tR）可用于定性。tRtRt0 v 调整保留体积(adjusted retention volume，VR)-扣除死体积后 的保留体积。16您 的 创 新 药 物 研 发 伙 伴HPLC的基本概念和理论梯度 v HPLC有等强度(isocratic)和梯度(gradient)洗脱两种方式。等度洗脱 是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少 ，性质差别不大的样品。梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制 流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于分析组 分数目多、性质
13、差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可以缩短分 析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常常引 起基线漂移和降低重现性。 v 梯度洗脱有两种实现方式：低压梯度（外梯度）和高压梯度（内 梯度）。 v 两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多种洗脱曲线 ：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯度。线性梯度最常 用，尤其适合于在反相柱上进行梯度洗脱。17您 的 创 新 药 物 研 发 伙 伴HPLC的基本概念和理论18您 的 创 新 药 物 研 发 伙 伴HPLC的基本概念和理论19您 的 创 新 药 物 研 发 伙 伴HPLC的基本概念和理论在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成
14、不断变化， 因此带来一些特殊问题，必须充分重视： v 要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗 脱的流动相。有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不 互溶，使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时， 还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。 v 梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现 性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂 质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗 脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产 生气泡。20您 的 创 新 药 物 研 发 伙 伴HPLC的基本概念和理论v 混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱
15、时常 出现压力的变化。例如甲醇和水粘度都较小，当二者以相近 比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流 动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输 液泵或色谱柱能承受的最大压力。 v 每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢 复到初始状态。需让1030倍柱容积的初始流动相流经色谱柱 ，使固定相与初始流动相达到完全平衡。21您 的 创 新 药 物 研 发 伙 伴HPLC系统v HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记 录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键 部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样 器、预柱或保护柱、柱温控制器
16、等，现代HPLC仪还有微机控 制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC仪还 备有自动馏分收集装置。 v 目前常见的HPLC仪生产厂家国外有Waters公司、Agilent公司 （原HP公司）、岛津公司等，国内有大连依利特公司、上海 分析仪器厂、北京分析仪器厂等。22您 的 创 新 药 物 研 发 伙 伴HPLC系统23您 的 创 新 药 物 研 发 伙 伴HPLC系统24您 的 创 新 药 物 研 发 伙 伴HPLC系统-输液泵输液泵 1泵的构造和性能 v 输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。泵的性能好坏直 接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。输液泵应具 备如下性能：流量稳定，其RSD（相对标准偏差）应 0.5%，这对定性定量的准确性至关重要；流量范围宽，分析型应在0.110 ml/min范围内连续可调，制备型应能达到100 ml/min；输出压力高，一般应能达到150300kg/cm
