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1、抗癌药物敏感实验一.实验药物储备液的配制v一般按试验最高浓度的100倍配制储备液 。v体外药物敏感性试验所用药物浓度，一般 根据血浆高峰浓度的0.10，1，10倍的剂量 进行。亦可参考以下公式：试验药物浓度（ug/ml）v试验时，一般3-5个对数级浓度平均体重 60mg平均体表面积 100二.受试细胞的准备根据实验目的选用体外培养的肿瘤 细胞系如国际通用的Hela细胞系等， 也可用肿瘤患者的新鲜手术标本制成 细胞悬液备用。三.药物疗效的评价1.体外抑瘤试验：合成化合物或植物 提取物纯品的半数抑制浓度IC50 10ug/ml或植物粗提物的IC50 20ug/ml，并且有细胞毒性的剂量依 赖关系，
2、其最高抑制效应达80以上 ；发酵液IC50大于1：100，则判定样 品在体外对细胞有杀伤作用。2.体内抑瘤试验：v实体瘤疗效以瘤重抑制百分率表示，即瘤重抑制率（1-试验组瘤重/对照组瘤重） 100 中草药抑制率30，合成药40v腹水型肿瘤疗效可以生命延长率表示，即生命延长率（试验组存活天数/对照组存活天数-1） 100非腹腔给药生命延长率50，腹腔给药 生命延长率75四.药物敏感性实验1.体外药物敏感试验美蓝法：利用活细胞的脱氢酶 提供氢离子，是美蓝还原为甲烯白 （无色）。细胞死亡后脱氢酶失活 无法使美蓝还原，故染成蓝色。检 验用药后死细胞数反映药物抑瘤作 用。假阳性率较高。2.染料排斥实验法
3、：根据活细胞在低浓度染液不着 色特点，一般用0.2台盼蓝或0.1 伊红试验。药物导致细胞死亡时 ，细胞膜通透性增加，染料易透过 细胞膜。加药后计算阳性细胞数以 示药效。由于濒临死亡的细胞不易 着色，故假阴性较高。3.生长曲线测定法1）药物对细胞的杀伤率将对照组及加药组生长曲线的线性部 分延伸至Y轴，可分别得到截距NO及NO 。代表接种后具有增殖力的细胞数。药物对增殖细胞的杀伤率 （ NO NO）/ NO100 2）药物对倍增时间（TD)的影响TD = t 2Nt N0t代表培养时间， N0 和Nt分别代 表接种后及培养1小时后的细胞数。 如倍增时间延长则表明药物使细胞增 殖能力减弱。3）药物对
4、细胞生长饱和密度（Ns）的影响取出在生长稳定期的培养细胞，计数单 位面积或体积的细胞均数，即细胞生长饱和 密度。该值减小也表示细胞增殖活性减弱。4）放射性同位素掺入核苷酸前体物试验法常用3H-TDR或3H-UDR掺入DNA或RNA合成 期的细胞，用液体闪烁计数仪测知标记的DNA 或RNA的含量，从而了解药物对肿瘤细胞DNA 或RNA合成的抑制效应。5）四唑盐（MTT）比色法Mosmann（1983）首先报道此法。简便 快速，便于大规模进行药敏试验，误差小 且精确，无放射性污染。广泛应用于临床 。接种细胞 培养细胞 3-5天后每孔 加入MTT溶液（5mg/ml）20ul，孵育4h终止 培养吸弃上
5、清 每孔加150ulDMSO振荡 10min 比色：选择490nm波长酶联免疫 检测仪测定光吸收值并绘制吸收曲线6）三磷酸腺苷生物发光法（ATP bioluminesence assay）是一种敏感可靠能测定各种细胞活 力的方法。7）集落形成试验法8）3H亮氨酸掺入细胞蛋白质试验法9）抗癌药物的效能比测定法2.体内抗癌药物敏感试验1）裸鼠移植瘤试验1973年丹麦的C.W.Friis在BALB/cA 近交系小鼠中发现自发性突变的无毛 小鼠，该突变小鼠胸腺发育不良，免 疫T细胞缺失，而培育成了BALB/cA-nu 。之后引至日本实验动物中央研究所 ，1989年自日本实验动物中央研究所 引入到中科院
6、上海实验动物中心。裸鼠特点:v先天性胸腺缺损v胸腺依赖性免疫功能缺乏，T细胞功能 接近于零，但B细胞功能基本正常v异种移植时无排斥反应故可以进行人体肿瘤异种移植。2）小鼠肾包膜下肿瘤移植试验1978年Bogden首先报道了将人肿瘤组织移植于裸鼠肾包膜下的六天药敏试验方法。细胞的克隆化技术细胞克隆（cell cloning）：又 称单细胞克隆，即把单个细胞从群体 内分离出来单独培养，使之重新繁衍 成一个新的细胞群体的培养技术。原代培养细胞和有限细胞洗（二 倍体细胞）比较困难，无限细胞系， 转化细胞系和肿瘤细胞则较容易。一.克隆培养（clone culture）技术1.稀释铺板法消化法制备低密度细
7、胞悬液（12个/ml） 0.5ml/孔接种于培养板 612h后观察标记含单个细胞的孔 待孔内细胞增至500-600个时进行分离培养 分离扩大培养2.饲养层克隆法v 饲养细胞（feeder cell）： 为了使刚刚克隆化的极少量细胞生 长繁殖，在培养皿中加入能贴壁生 长的其它细胞。 v 常用细胞：成纤维细胞，胸腺 细胞，巨噬细胞。 v 饲养细胞制备繁琐，应用较少 。3.胶原模板或血纤维蛋白膜层板克隆法用胶原膜层或血纤维膜层取代饲养 细胞，帮助单个细胞和密度极低的分散 细胞黏附和贴壁，存活并繁殖。4.琼脂克隆法琼脂是生长基质层帮助细胞贴附生 长。适于病毒转化细胞和恶性转化细胞 。5.在琼脂基底上用
8、甲基纤维素克隆化二.影响克隆形成率的因素接种众多单个分散细胞，经培养后能 够增生形成克隆的百分数称克隆率或接种 率（cloning efficiency）。影响因素：接种细胞密度： 细胞悬液的细胞密度越 大,克隆形成率越低培养基：Ham F12K培养液是最好的克隆化 培养液。血清：胎牛血清好于小牛血清。饲养细胞：有利于克隆的形成。激素和生长因子：胰岛素，地塞米松， 表皮生长因子等可以促进不同细胞生长 。CO2: 对绝大多数细胞克隆形成率有提 高作用，常用5浓度。适应性生长基质：不同细胞采用不同生 长基质。三.克隆的分离1.克隆化环分离法2.射线照射分离法3.半固体培养基悬浮培养细胞克 隆分离法
