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1、第二部分 微生物的代谢 生物大分子降解为小分子 代谢中间体-丙酮酸 TCA环 发酵与呼吸 代谢中能量的释放与利用 合成代谢 次级代谢与调节 代谢控制发酵 发酵工艺基础知识生物大分子分解微生物发酵基质主要包括淀粉、蛋白 质、纤维素、果胶、核酸、脂类等淀粉淀粉酶液化型 糖化型 （a淀粉酶）葡糖生成酶淀粉酶异淀粉酶葡萄糖1、（淀粉1，4葡萄糖苷酶）（淀粉1，6葡萄糖苷酶）（淀粉1，4麦芽糖苷酶）工业上常用的碳源（carbon source）1.谷物淀粉（玉米、马铃薯、木薯淀粉） 应用最广。使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类。缺点：a.难利用、发酵液比较稠、一般2.0%时加入一定的-淀粉酶
2、。b.成分较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等。优点：来源广泛、价格低，可解除葡萄糖效应。 2. 葡萄糖 所有的微生物都能利用葡萄糖，但会引起葡萄糖效应。 工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一定的质量指标。DE值：dextrose equivalent value（葡萄糖当量值）表示淀粉糖的含糖量。还原糖含量（） DE值 100干物质含量（）淀粉水解糖的制备方法及原理（一）酸解法（acid hydrolysis method）以酸为催化剂，在高温高压下使淀粉水解生成葡萄糖的方法。1.水解过程：总反应式： (C6H10O5)n+nH2O nC6H12O6过程：(C6H10O5)n (C6H10O5
3、)x C12H22O11 C6H12O6淀粉 糊精 麦芽糖 葡萄糖H+对作用点无选择性，-1,4-糖苷键和-1,6-糖苷键均被切断。评价 优点：工艺简单，水解时间短，生产效率高，设备周转快。 缺点： （1）副产物多，影响糖液纯度，一般DE值只有90左右。 （2）对淀粉原料要求严格，不能用粗淀粉，只能用纯度较高的精制 淀粉。淀粉葡萄糖复合二糖 5羟甲基糠醛复合低聚糖 有机酸、有色物质损失葡萄糖量 7 1复合反应分解反应盐酸酶解法（enzyme hydrolysis method）用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的工艺。分两步：（1）液化：用-淀粉酶将淀粉转化为糊精和低聚糖（2）糖化
4、：用糖化酶（又称葡萄糖淀粉酶）将糊精 和低聚糖转化为葡萄糖。所以，淀粉的液化和糖化均在酶作用下进行，又称双酶法(double enzyme hydrolysis method)。1.液化（liquification）2. 淀粉酶水解底物内部的1,4糖苷键，不能水解1,6糖苷键，一般采用耐高温淀粉酶，使液化速度加快。8590度 。液化程度的控制（液化后需糖化的原因）a. 糖液的DE值低（-淀粉酶不能水解-1,6糖苷键）b. 液化在较高温度下进行，液化时间加长，淀粉老化，使糖化酶难以利用。c. 糖化酶水解的底物分子要求有一定的大小范围。根据生产经验，DE值在2030之间为好，液化终点可通过碘液判断
5、，此时呈棕色。2. 糖化（saccharification）糖化酶从非还原性末端水解-1,4糖苷键和-1,6糖苷键。终点确定：DE值达最高时，停止酶反应。3.评价优点： （1）反应条件温和，不需高温、高压设备。（2）副反应少，水解糖液纯度高。（3）对原料要求粗放，可用粗原料并在较高淀粉乳浓度下水解。（4）糖液颜色浅，质量高。缺点：（1）生产周期长，一般需要48小时。（2）需要更多的设备，且操作严格。（三）酸酶结合法（acid-enzyme hydrolysis method）集酸解法和酶解法的优点而采取的生产工艺。根据原料淀粉性质分： 1.酸酶法：先将淀粉酸水解成糊精和低聚 糖，再用糖化酶将其
6、水解为葡萄糖。2. 适用：淀粉颗粒坚硬（如玉米、小麦）的原 料，若用-淀粉酶液化，短时间液化，反应往往不彻底。2.酶酸法：先用-淀粉酶液化，再用酸水解。适用：颗粒大小不一（如碎米淀粉）的淀粉原料，若用酸法，则水解不均匀。 （四）不同糖化工艺的比较项目酸解法酸酶结合法酶解法 DE值919598 羟甲基糠醛（） 0.30.0080.003 色度100.30.2 淀粉转化率909598 工艺条件高温加压高温加压常温 过程耗能多多少 副产物多中少 生产周期短中长 设备规模小中大 防腐要求高较高低 适合发酵工艺情况 差中有利2. 纤维素的降解纤维素是自然界中最丰富的可再生资源，占地球总生物量的40%，它
7、也是 地球生物圈碳素和能量循环的主要部分。由于纤维素具有水不溶性的高结 晶构造，其外围又被木质素层包围着，要把它水解成可利用的葡萄糖相当 困难，所以到目前为止仍没有得到很好地利用。 近几年随着原油价格的 不断攀升，纤维素资源的利用引起了世界各国的极大关注和高度重视。我 国出于对能源战略的考虑，近几年也加大了对纤维素利用的研究的投入。 （1）纤维素的结构天然纤维素是由D-吡喃式葡萄糖通过-1,4-糖苷键结合形成的线形长链分 子，约由700-150,000个左右的残基所构成，一般在3000个左右。 通过分子间的氢键(O3-HO5 and O6 H-O2) 和分子链间 的氢键 (O6-H O3) 形
8、成网状平面 并通过疏水面的堆积构成 纤维素的晶体结构。O3-HO5O6 H-O2O6-H O3天然纤维素除了我们上面提到的结晶结构外，还有非结晶 区。如下图。结晶区无定形区微生物降解纤维素的酶系降解和利用水不溶性的纤维素，微生物必须产生相应的酶。 在过去二十几年里，根据酶对纤维素作用方式的研究，将纤 维素降解的酶类分成三类：(i) 纤维素内切酶 endoglucanases or 1,4-D-glucan-4- glucanohydrolases (EC 3.2.1.4) (ii) 纤维素外切酶 exoglucanases, including 1,4-D-glucan glucanohydr
9、olases (also known as cellodextrinases) (EC 3.2.1.74) and 1,4Dglucan cellobiohydrolases (cellobiohydrolases) (EC 3.2.1.91)(iii) 葡萄糖苷酶-glucosidases or -glucoside glucohydrolases (EC3.2.1.21). 纤维素内切酶随机在纤维素的无定形区将糖链切断，产生新 的链端。纤维素外切酶作用于纤维素链的两端产生纤维二糖 。葡萄糖苷酶降解纤维素湖精和纤维二糖为葡萄糖。教材上也将纤维素酶分为三种C1酶、 CX酶及葡萄糖苷酶天然纤维素
10、 短链纤维素 葡萄糖 纤维二糖纤维寡糖纤维二糖葡萄糖C1酶CX酶葡萄糖苷酶by Small Angle X-ray Scattering. J.Biol.Chem. Vol. 277 pp. 4088740892, 2002纤维素酶的结构可以分成三个部分：催化结构域、吸附结构域和连接肽。 纤维素酶对纤维素的作用是一个识别、吸附和催化的过程。纤维素酶的结构和作用机理3、果胶 半乳糖醛酸以a-1，4糖苷键形成的直链高分子 化合物，常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖 、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链，游离 的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子，特别是 与硼化合物结合在一起 75%羧基甲基化成甲酯从广义上讲
11、，果胶酶可以被分为3种类型：原果胶酶：可以把不溶于水的原果 胶分解为可溶于水的高聚合体果胶；果胶甲酯水解酶：脱去果胶中的甲氧基 基团，促使果胶的脱甲酯作用；果胶聚半乳糖醛酸（解聚酶）：促使果胶中D -半乳糖醛酸的-1，4糖苷键的裂解。目前国内外研究和应用较多的果胶酶产生菌是细菌和霉菌，也有链霉菌产生果胶 酶的报道。在细菌中，欧文氏杆菌(Erwinia sp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、节杆菌 (Arthrobacter sp.)和假单胞杆菌(Pseodomonas sp.)都产生果胶酶。嗜碱性芽孢杆菌 属和欧文氏杆菌属主要用于在苎麻和红麻的脱胶、生物制浆及污物的处理软化等 方面，
12、应用前景可观，受到较多的关注和研究。已见报道的产果胶酶的霉菌种类 大约包括20个属， 如曲霉属(Aspergillus sp.)、灰霉菌属(Botrytis sp.)、镰孢菌属 (Fusarium sp.)、炭疽菌属(Colletotrichum sp.)、核盘菌属(Scletorium sp.)和玉圆斑菌 属(Cochliobolus sp.)等。目前，黑曲霉、根霉和盾壳霉作为产果胶酶的菌株已经商 品化。国内外对霉菌发酵产果胶酶的研究主要集中在曲霉属中，而曲霉属中研究 最多的是黑曲霉。其原因是，果胶酶被广泛应用于食品工业中，如用于果汁、果 酒及中药营养液的深加工等，使得产品质量和外观得以改善
13、，而生产食品酶制剂 的菌株必须是安全菌株。黑曲霉分泌的胞外酶系较全，不仅可以产生大量果胶酶 ，而且黑曲霉属于安全菌株。另外，黑曲霉产生的果胶酶最适pH值一般在酸性范 围内，这也是其被应用于食品工业行业中的原因之一研究进展果胶酶 微生物来源蛋白酶制剂常按最适pH分类碱性：pH10以上（2709枯草菌蛋白酶）酸性：pH2-3以下 黑曲霉中性：多 蛋白酶分类：内肽酶 （蛋白酶） 外肽酶 羧肽酶、氨肽酶蛋白酶按活性中心可分为丝氨酸蛋白酶、天门冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白 酶和金属蛋白酶；按最适pH值来分又分酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白 酶葡萄糖 丙酮酸 CO2和H2O蛋白、核酸降解自己了解（教材或生
14、物化学）生物大分子微生物小分子代谢的中间体丙酮酸葡萄糖 酵解途径 丙酮酸 糖异生途径 乳酸、氨基酸、甘油 糖原 肝糖原分解 糖原合成 核糖+ NADPH+H+磷酸戊糖途径 淀粉 纤维素消化与吸收 丙酮酸位于无氧分解和有氧分解的交界点上，是糖代谢中具有关键作用的中间产物 从丙酮酸可直接生成丙氨酸，因为它可以与氨基转移反应相结合，故在氮代谢方面也起着重要的作用 和CoA反应能形成乙酰CoA，与脂肪酸的代谢也有重要的关系 因此，丙酮酸在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用 丙酮酸合成路线主要有酒石酸 与焦硫酸钾合成法、乳酸乙酯 空气氧化法、羟基丙酮法、葡 萄糖发酵法等 丙酮酸是一种用 途非常广
15、泛的有 机酸，在化工、 制药和日用化学 品等工业及科学 研究中有着广泛 的用途 从代谢的角度看丙酮酸需要掌握的知识 发酵 (fermentation),呼吸作用,氧化磷酸化, 底物水平磷酸化,新陈代谢,同型乳酸发酵, 异型乳酸发酵,双歧杆菌发酵 葡糖分解为丙酮酸的途径 EMP途径特点、关键酶 HMP途径的重要意义、关键酶 ED途径的特点、关键酶 磷酸己糖酮解途径的特点、关键酶 TCA循环的重要特点单糖分解为丙酮酸的四（五）种途径 分解葡萄糖生成丙酮酸的过程 糖酵解在胞浆中进行 葡糖糖需磷酸活化 1分子葡萄糖经酵解可净生成2分子ATP 是细胞摄入体内的葡萄糖最初经历的酶促分解过程，也是葡萄糖分解代 谢所经历的共同途径 是机体在缺氧情况下迅速获得能量的主要途径，也是成熟红细胞获得能 量的唯一途径 糖酵解是肿瘤细胞能量代谢的主要方式 关于糖酵解的认识EMP途径绝大多数微生物均存在,连接TCA、HMP、ED等途径的桥梁,提供ATP和NAD(P)H HMP戊糖代谢，提供NADPH 和碳骨架 ED 不依赖上面两途径单独纯在，补偿途径 PK and HK 某些细菌中（一）
