生物分离与纯化技术

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1、生 物 分 离 与 纯 化 技 术主讲：魏秋红 电话：13323951859邮箱：参考书n生物分离与纯化技术 科学出版社 辛秀兰编n生物工业下游技术 中国轻工出版社 毛忠贵编n生化分离工程 化学工业出版社 严希康 编著n生物分离原理与技术 化学工业出版社 欧阳平凯 编著n生物分离工程 化学工业出版社 孙彦编 第一篇 技术理论篇o第一章 绪论o第二章 预处理技术o第三章 固相析出分离技术o第四章 色谱分离技术o第五章 过滤与膜分离技术o第六章 萃取技术o第七章 浓缩干燥技术n第三节 生物分离纯化技术的发展第一章 绪 论n 第一节 生化分离纯化的概念和原理n 第二节 分离纯化策略指从发酵液、动植物

2、细胞培养液、酶反应液或动植物组织细胞与体液等中分离、纯化生物产品的过程。第一节 生物分离纯化的概念与原理生物分离纯化概念：（8）动物器官或组织制剂一、生物物质及来源 1.生物物质：（1）氨基酸及其衍生物类 （2）活性多肽类 （3）蛋白质类 （4） 酶类 （5）核酸及其降解物类 （6）糖类 （7） 脂质类（9）小动物制剂 （10）菌体制剂一、生物物质及来源2.生物物质来源：（1）动物器官与组织（2）植物器官与组织（3）微生物及其代谢产物（4） 细胞培养产物（5）血液、分泌物及其代谢物下游：生物产品的回收生物分离与纯化技术，主要包括离心技术、细胞破碎 技术、萃取技术、固相析出技术、色谱 技术和膜分

3、离技术等。二、分离纯化技术生物技术 上游：基因工程、细胞工程、酶工程、 发酵工程及组织工程、 三、分离纯化基本原理生物材料生物材料上游加工非均相混合物均相混合物分离纯化的本质：有效识别混合物中不同组分间物理、化学 和生物学性质的差别，利用能够识别这些 差别的分离介质或扩大这些差别的分离设 备来实现组分间的分离或目标产物的纯化 。选择依据1.物理性质o(1)分子形状、大小 包括密度、几 何尺寸和形状。o(2)溶解度、挥发性 包括密度、几 何尺寸和形状。o(3)分子极性即电荷性质 包括溶质 得电荷特性、电荷分布、等电点等。o(4)流动性 包括黏度、在特定溶液 中的扩散系数等。2.化学性质o(1)分

4、子间的相互作用 包括分子间 的范德华力、氢键、离子间的静电引 力及疏水作用大小等。o(2)分子识别 即通过目的产物与某 些分离纯化介质上的活性中心、基团 进行的专一性结合。o(3)化学反应pH6.3 加酸 pH2.4 谷氨酸锌离子 谷氨酸锌沉淀 溶液 谷氨酸结晶3.生物学性质o主要特征是生物大分子之间的分子识别和特异性结合。表1-1 生物分离纯化基本原理原理分离纯纯化技 术术产产物举举例分子大 小、形 状离心 超滤滤 微滤滤 透析 电电渗析 凝胶色谱谱菌体、细细胞碎片、蛋白质质 蛋白质质、多醣醣、抗生素 菌体、细细胞 尿素、盐盐、蛋白质质 氨基酸、有机酸、盐盐、水 盐盐、分子大小不同的蛋白质质

5、溶解度 、挥发挥发 性萃取 盐盐析 结结晶 蒸馏馏 等电电点沉淀 有机溶剂剂沉淀氨基酸、有机酸、抗生素、蛋白质质、香料 蛋白质质、核酸 氨基酸、有机酸、抗生素、蛋白质质 乙醇、香精 蛋白质质、氨基酸 蛋白质质、核酸表1-1 生物分离纯化基本原理原理 分离纯纯化技术术产产物举举例带电带电 性电电泳 离子交换换色谱谱 等电电点沉淀蛋白质质、核酸、氨基酸 氨基酸、有机酸、抗生素、蛋白质质、核酸 蛋白质质、氨基酸化学 性质质电电渗析 离子交换换色谱谱 亲亲和色谱谱氨基酸、有机酸、盐盐、水 氨基酸、有机酸、抗生素、蛋白质质、核酸 蛋白质质、核酸生物 功能 特性亲亲和色谱谱 疏水色谱谱蛋白质质、核酸 蛋白

6、质质、核酸 第二节 分离纯化策略n1.环境复杂、分离纯化困难一、生物分离纯化技术的特点n2.含量低、工艺复杂n3.稳定性差、操纵要求严格n4.目标产物最终的质量要求很高n5.终极产品纯度的均一性与化学分离上纯度的概念并不完全相同二、 分离纯化方法选择的原则n1) 技术路线、工艺流程尽量简单化；n2) 尽可能采用低成本的材料与设备；n3) 将完整工艺流程划分为不同的工序；n4) 注意时效性；n5) 采用成熟技术和可靠设备；n6) 准备好书面标准操作程序等技术文件；n7) 检测纯化过程中产物产量和活性三、分离纯化的原材料选择与成品保存o1.原材料的选择(1)来源 (2)与目标产物含量相关的因素 合

7、适的生物品种合适的组织器官 生物材料的种属特异性合适的生长发育阶段合适的生理状态三、分离纯化的原材料选择与成品保存o2.天然生物材料的采后处理天然生物材料需要处理的原因 细胞自溶导致目标产物失活或降解；易受微生物污染导致目标产物失活或降解。易受光照 、氧气等的作用导致其分子结构改变。 一般植物材料需进行适当的干燥后再保存 动物材料需经清洗后速冻、有机溶剂脱水 或制成丙酮粉在低温下保存三、分离纯化的原材料选择与成品保存o3.成品的保存 (1)影响生物产品保存的主要因素空气温度水分 光线pH保存期避空气 低温避光缓冲液三、分离纯化的原材料选择与成品保存 3.成品的保存(2)蛋白质和酶制品的保存方法

8、 低温下保存制成干粉或结晶保存保存时添加保护剂 a.惰性的生化或有机化合物b.中性盐c.巯基试剂-205 ， -70最好。MgSO4 、 NaCl 、(NH4)2SO4等糖类、脂肪酸、牛血清白蛋白、氨基酸、多元醇等半胱氨酸或巯基乙醇四、分离纯化的准备工作o1.软件材料的准备(1)生产文件的准备(2)生产人员的培训o2.硬件材料的准备(1)生产设施、仪器设备与器皿等(2)工艺处理液的准备* 五、分离纯化的基本步骤发酵液的预处理初步纯化(分离提取)高度纯化（精制）成品加工固液分离生物分离与纯化的一般工艺过程发酵液预处理细胞分离细胞破碎细胞碎片分离初步纯化胞 外 产 物高度纯化成品加工发酵液的 预处

9、理与 固液分离生物分离与纯化的一般工艺过程六、分离纯化技术的综合运用与工艺放大一种合格产品要运用多种分离设备和技术进 行纯化，原因为： 在每个工序中根据现有设备条件和目标产 物的性质、规格、用途不同可采用多种分离 纯化手段；每种分离纯化操作本身各项影响加工效 果的因素都直接影响分离纯化的效果和成本；各工序间具有复杂的相互影响作用。 必须保证上一工序工艺处理条件和产物的 质量适于下一工序的加工需要 六、分离纯化技术的综合运用与工艺放大 1.建立在制品、半制品成品上的检测方法 是工艺优化的前提 在线检测 、数据检测和放行检测经济性考虑收率和纯度之间的平衡 结合对产物质量的要求、加工成本、技术上 的

10、可行性和可靠性、价值以及市场需求等找 出产物纯度、生物活性和产量间的平衡点2.明确优化工艺的评判标准，处理好收率、 纯度、经济性之间的平衡六、分离纯化技术的综合运用与工艺放大经济性考虑收率和纯度之间的平衡 2.明确优化工艺的评判标准，处理好收率、 纯度、经济性之间的平衡应将处理体积大、加工成本低的工序尽量 前置，而价格昂贵、精制工序易放在工艺 流程的后段。随产物纯度的提高，对工艺 流程下游加工所用的设备、试剂的要求亦 提高。七、分离纯化的中试放大1.中试放大具备的条件2.中试放大中力求解决及注意的问题3.中试放大的方法4.中试放大的关键环节1.中试放大具备的条件确定并系统鉴定了生物材料的资源目

11、标产物的收率稳定即重复性好，质量可靠工艺路线和操作条件已经确定，并且已经建 立了原料、半制品、产品的的分析检测方法 已经进行过物料平衡预算，并且建立了“三 废”的处理和监测方法 确立了中试规模及所需原材料的规格和数量建立了教完善的安全生产预警措施和方法(1)进一步确定生产中所需原辅料的规格和来源中试应采用容易获得成本较低的原辅材料许可范围和最适工艺条件2.中试放大中力求解决及注意的问题(2)进一步确定生产设备的选型与设备材料的质量(3)进一步确定分离纯化操作的条件限度(4)研究和建立原辅材料、中间体及产品质量的 分析方法和手段经验放大法3.中试放大的方法相似放大法数学模型放大法步步为营法一竿子

12、插到底法中试放大 的程序4.中试放大的关键环节工艺路线及各工序操作步骤设备材质与型号的选择 原辅材料、中间体的质量标准 操作条件物料衡算安全生产与“三废”防治 原辅材料、中间体及产品的理化和生物学测定消耗定额、原料成本、操作工时与生产周期 等的计算1.验证的概念2.药品生产验证的主要内容3.生产工艺验证八、生物药品生产工艺的验证1.验证的概念证明任何程序、生产过程、设备、物料、 活动或系统确实能达到预期结果的有文件 明的一系列活动。设备与厂房和公用设施验证 工艺验证分析方法验证 计算机验证清洁验证2.药品生产验证的主要内容(1)生产工艺验证的目的3.生产工艺的验证(2)工艺验证的主要形式(3)

13、工艺验证的一般要求(4)工艺验证的主要内容(5)验证文件(1) 生产工艺验证的目的证明各单元操作的工艺条件以及操作是否能适合该产品的常规生产，并证明在使用规定的原辅材料及设备的条件下，能始终生产出符合预定质量标准要求的产品，且具有良好的重现性和可靠性。 (2) 工艺验证的主要形式工艺定型前验证是指一项工艺、一个系统、 一台设备或一种材料正式投入使用前按照设定 方案进行的验证。回顾性验证是指以历史数据的统计分析为 基础的旨在证实生产工艺条件适用性的验证。同步验证是指生产中某项工艺运行时进行 的实时验证，以从工艺实际运行过程中获得 数据，从而确保某项工艺达到预定要求的活动。(3) 工艺验证的一般要

14、求只有在所使用的设备或设施已完成安装确 定、运行确定、性能确定、具备了适当的产品 质量标准且检验方法已经过验证的基础上实施。一般要求至少做三批连续的成功批号。新产品的工艺验证回顾性验证的要求是收集近期生产的至少 1030批的数据进行分析评估在下列条件下，需对工艺进行再验证开放批工艺验证 a.工艺发生改变，生产使用的设备作了调整、 更换或大修。b.生产场所发生改变。c.在产品的趋势分析中发现严重的超常现象 或可能对药品的安全、性状、纯度、杂质、 含量等有影响。d.生产了一定周期后，一般周期件再验证最多 不超过3年。在下列条件下，需对工艺进行再验证(4) 工艺验证的主要内容 关键工艺步骤的验证关键

15、工艺参数的验证工艺一致性验证物料配料比、物料浓度、操作温度、pH、压 力 、时间等。有相变的步骤；改变温度或pH的步骤；多种 原料的混合及引起表面积、颗粒度、堆积密度 或均匀性变化的步骤。 参数划分可考虑：质量因素、安全因素、环保 因素、经济因素。a.为取得试生产文号目的，应提供三批生产工 艺一致性的数据，且三批制品质量合格。b.为达到试生产文号转为正式生产文号的目的 ，应提供两年试生产期间所用的工艺加工多批 产品的有关工艺参数和制品质量一致性资料。c.从工艺控制的观点出发有必要确定在正常生 产条件下工艺参数和制品质量指标的变化范围。工艺一致性验证 通常有三种情况：(5) 验证文件工艺验证方案工艺验证报告验证目的和依据、工艺描述、关键工艺参数、 验证计划、取样计划、可接受标准、附加研 究培训等。 验证目的和依据、工艺描述、关键工艺参数、 验证批号、验证结果、偏差、附加研究、培 训结论、验证批生产记录和所有中间体与成 品的检验报告。 第三节 生物分离纯化技术的发展一、生物分离纯化技术的发展历史二、生物分离纯化技术的发展趋势主要指19世纪60年代到20世纪40年代青霉素等抗 生素出现之前的生物技术产业。这一时期特点是产品 大多属于嫌气发酵过程的产物（如酒精、丙酮、丁酮 等），其产品相对简单，基本