《实验四培养基的制备与灭菌》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验四培养基的制备与灭菌（39页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实 验 四微生物培养基的配制和灭菌微生物培养基的配制和灭菌目的要求实验材料实验程序目 的 要 求了解培养基的配制原理和方法，掌握其 配制过程。了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和 加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。熟悉分离、培养微生物前的有关准备工 作及操作方法。实 验 材 料药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可 溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO47H2O、FeSO47H2O 等。高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、细菌过滤器、紫外线杀 菌灯。其它：天平、牛角匙、电炉、2M HCl、2M NaOH、pH试 纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠的 三角瓶、带棉塞
2、的无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸 管、各种包装纸、防水纸、绳索、棉花、标签等。实 验 程 序培养基的配制分离培养微生物常用器皿的准备培养基和玻璃器材的灭菌方法实验程序1:培养基的配制培养基培养基的配制原则培养基的种类培养基的配制方法和步骤培养基的配方及配制无菌水的制备培养基是人工配制的适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。它是进行科学研究，发酵生产微生物制品等的基础 。培养基的配制原则一、营养成分二、pH值三、渗透压四、氧化还原电位一、营养成分1. 根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基， 如自养型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物质组成。异养做生物的培养基至少
3、需要含有一种有机物质。按微生物的主要类群来说，又有细菌、放线菌、酵母菌和霉菌之分。它们所需要的培养基成分也不同，分 别称为牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号合成培养基，麦芽汁培养基，查氏合成培养基。培养基的配制原则碳源（carbon source）凡是提供微生物营养所需的碳 元素（碳架）的营养源，称为碳源。碳源物质的功能：构成细胞物质；为机体提供整个生 理活动所需要的能量（异养微生物）。微生物的碳源谱 无机含碳化合物：如CO2和碳酸盐等。 有机含碳化合物：糖与糖的衍生物、脂类、醇类。有机酸、 烃类、芳香族化合物以及各种含氮的化合物。培养基的配制原则氮源(nitrogen source) 凡是提供微生
4、物营养所需的氮元 素的营养源，称为氮源。氮源物质的主要作用是合成细胞物质中含氮物质，少 数自养细菌能利用铵盐、硝酸盐作为机体生长的氮源与能源 ，某些厌氧细菌在厌氧与糖类物质缺乏的条件下，也可以利 用氨基酸作为能源物质。实验室常用的无机氮源有碳酸铵、硝酸盐、硫酸铵、尿素 、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等。生产上常用的氮源有硝酸盐 、铵盐、尿素、氨以及蛋白含量较高的鱼粉、蚕蛹粉、黄豆 饼粉、花生饼份、玉米浆等。培养基的配制原则能源指能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营 养物或辐射能。微生物的能源谱：有机物：化能异养微生物的能源（同碳源）化学物质 能源谱： 无机物：化能自养微生物的能源（不同于碳源）辐
5、射能：光能自养和光能异养微生物的能源培养基的配制原则化能自养微生物的能源物质都是一些还原态的无机物 质，例如：NH4+、NO2-、S、H2S、H2、Fe2+ 等，能利用这 些物质作为能源的全部是细菌，如：硝酸细菌、亚硝酸菌 、硫化细菌、硫细菌、铁细菌、硫细菌、氢细菌和铁细菌 等。这些无机养料常常是双功能的（如： NH4+ 既是硝酸 细菌的能源，又是它的氮源。）有机营养物常有双功能或三功能作用，既是异养微生 物的能源，又是它们的碳源或氮源。辐射能是单功能的，只为光能微生物提供能源。培养基的配制原理2.注意各种营养物质的浓度与配比营养物的浓度：在一般情况下，浓度合适的营养 物质才对微生物表现出良好
6、作用，浓度大时对微生物 生长起抑制作用，浓度小时不能满足微生物生长的需 要。各营养物质之间的浓度比：培养基中各营养物质 之间的浓度比直接影响微生物的生长与繁殖和（或） 代谢产物的形成与积累，尤其是碳氮比（CN）（碳 氮比一般指培养基中元素碳与元素氮的比值，有时也 指培养基中还原糖与粗蛋白两种成分含量之比）的影 响更为明显。培养基的配制原则二.控制培养基的pH值各类微生物生长的最适pH各不相同，细菌 与放线菌生长的pH在77.5之间，酵母菌与霉菌 生长的pH值在4-5之间。在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物 质的利用和代谢产物的形成与积累，常会改变培 养基的pH值，为了维持培养基pH值的相对
7、恒定 ，通常采用下列两种方式： 内源调节：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的 碳酸盐；调节培养基的碳氮比。 外源调节：按实际需要流加酸或碱液培养基的配制原则三、渗透压注意营养物质要有适合的浓度，不能太 低满足不了生长的需要，太高则渗透压 太大，也会抑制微生物的生长培养基的配制原则四、氧化还原电位氧化还原电位越高，培养基的氧化活动 越强，在厌氧菌培养中，加入还原剂， 可降低自由氧的毒害。培养基的配制原则培养基的种类据组成成分可分为: 1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。 2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制 而成。 3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成
8、。从培养基的物理状态可分为 1.液体培养基：不加凝固剂（常用凝固剂为琼脂）的液体状态培 养基。 2.固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状 态的培养基或农副产品培养基。 3.半固体培养基：在液体培养基中加入0.20.5%凝固剂而成的 半固体状培养基。按照培养基的用途，可将其分为 1.加富培养基：加富培养基是指在普通培养基里加过血 、血清、动物（或植物）组织液或其他营养物质（或生 长因子）的一类营养丰富的培养基，用以培养某种或某 类营养要求苛刻的异养微生物 2.选择培养基：选择培养基是根据某种或某一类群微生 物的特殊营养需要或对某种化合物的敏感性不同而设计 出来的一类培养基。利用
9、这种培养基可以将某种或某类 微生物从混杂的微生物群体中分离出来。 3.鉴别培养基：普通培养基中加入能与某种代谢产物发 生反应的指示剂或化学药品，从而产生某种明显的特征 性变化，以区别不同的微生物培养基的种类 培养基的配制方法和步骤称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。调pH值：用2MNaOH或2MHCl调pH，用pH试纸对照。加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。分装：注意不要污染棉塞。包扎成捆，挂上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。灭菌备用：培养基灭菌后必须在370C下恒温培养24h，确定无 菌生长，方可使用。配制方法和步骤
10、配制方法和步骤配制方法和步骤配制方法和步骤糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖）蛋白胨水培养基葡萄糖蛋白胨水培养基柠檬酸盐培养基（斜面） 牛肉膏蛋白胨培养基（斜面、三角瓶）H2S培养基淀粉培养基 （三角瓶）高氏培养基 （三角瓶）培养基的配方H2S培养基蛋白胨：10g胱氨酸：0.1gNa2SO4 ：0.1g水：1000mlPH ：7.2滤纸条若干，浸于8%醋酸铅液，取出吹 干，分装入试管，灭菌。注意事项培养基配方在附录按照每组的安排来配制，每人配的不一定都相同按照书上的比例，但总量有变（所有配方均为 1000ml量，同学们需要根据不同要求换算）配溶液 调pH值 加琼脂粉 灭菌（在老师监督下进行）普通微生物
11、培养基配制可以使用自来水，在细胞 培养以及分子试验中需要区别对待实验程序2:分离培养微生物常用器皿的准备清洗一些玻璃仪器：如三角烧瓶、试管、培养皿、吸管等。棉塞的制作 包装培养皿和吸管等。实验程序3:培养基和玻璃器材的灭菌方法干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器加压蒸汽灭菌法 其步骤如下： 1.灭菌器内加入一定量的水，将用防水纸包扎好的物品放入其中 。2.接通电源，进行加热。 3. 排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭 排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排 气阀，待压力回复到0时再关闭排气阀。 4.当压力达15bl/in2（即1.05kg/cm2）时，
12、此时灭菌器内的温 度为1210C，维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、 氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。 5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀 ，然后打开灭菌器盖，取出物品。培养基和玻璃器 材的灭菌方法湿热灭菌法菌体吸收水分蛋白质较易凝固湿热的穿透力比干热大，水的传热能力比 许多非导体的固体强湿热的蒸汽有潜热存在，1g水在100由 液态变为固态可放出2.26kJ，可增强灭菌 效果培养基和玻璃器 材的灭菌方法培养基和玻璃器 材的灭菌方法培养基和玻璃器 材的灭菌方法间歇灭菌法： 待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1 次，每次煮沸1h，连续3d重复进行
13、。在每两次 蒸煮之间，将物品（指培养基）放在370C恒温 条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死 残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭 。培养基和玻璃器 材的灭菌方法过滤除菌法： 不能用加热灭菌的液体物质（如维 生素、血清），一般可用细菌过滤 器进行除菌。培养基和玻璃器 材的灭菌方法紫外线灭菌法： 一般30W灯管，9m3空间，距地面2m每次打开紫外线照射0.5h ，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒 剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱， 即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于 空气及表面杀菌。培养基和玻璃器 材的灭菌方法化学药剂消毒灭菌： 微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛 、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂 白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌 剂，有的是抑菌剂。培养基和玻璃
