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1、第四节 微生物培养法概论微生物培养装置的基本条件：按微生物的生长规律进行科学设计；能提供丰富而均衡的营养物质；保证微生物获得适宜的温度和良好的通气条 件（厌氧菌除外）；提供一个适宜的理化条件；严防杂菌污染。 从少量培养发展到大规模培养； 从浅层培养发展到厚层（固体制曲）或深层（液体搅拌）培养； 从以固体培养技术为主发展到以液体培养技术为主； 从静止式液体培养发展到通气搅拌式的液体培养； 从单批培养发展到连续培养以至多级连续培养； 从利用分散的微生物细胞发展到利用固定化的细胞集团；微生物培养技术的发展特点： 从单纯利用微生物细胞到利用动、植物细胞进行大规模培养； 从利用野生型菌种发展到利用变异株
2、甚至遗传工程菌株； 从单菌发酵发展到混菌发酵； 从低密度培养发展到高密度培养（high cell-density culture，HCDC）； 从人工控制的发酵罐到多传感器、计算机在线控制的自动化发酵罐等；微生物的培养方法可分为八个大类一、实验室培养法（一）固体培养法1.好氧菌的固体培养试管斜面（test-tube slant）培养皿琼脂平板（agar plate）克氏扁瓶（kolle flask）茄子瓶（4）厌氧罐（anaerobic jar）（1）高层琼脂柱（2）厌氧培养皿（3）亨盖特滚管技术（hungate roll-tube technique）（5）厌氧手套箱（anaerobic g
3、love box）厌氧菌固体培养的具体方法 2.厌氧菌的固体培养（1）高层琼脂柱把含有还原剂的固体或半固体培养基装入试管中，经灭菌后，除表层上有一些溶解氧外，越是深层，其氧化还原势越低，故有利于厌氧菌的生长。例如，韦荣氏管（Veillon tube）是由一根长25cm、内径1cm，两端可用橡皮塞封闭的玻璃管，可作稀释、分离厌氧菌并对其进行菌落计数。（2）厌氧培养皿 利用特制皿盖去创造一个狭窄空间，加上还原性培养基的配合使用而达到厌氧培养的目的，例如，Brewer皿 利用特制皿底有两个相互隔开的空间，其一放焦性没食子酸，另一则放NaOH溶液，待在皿盖平板上接入待培养的厌氧菌后，立即密闭之，经摇动
4、，使两试剂接触而发生吸氧反应，从而造成无氧环境，例如，Spray皿或Bray皿（3）亨盖特滚管技术（hungate roll-tube technique）由著名美国微生物学家R.E.Hungate 于1950年分离瘤胃微生物和产甲烷菌等严格厌氧菌时设计的一种具有划时代意义的严格厌氧技术亨盖特滚管技术（Hungate roll-tube technique）。其主要原理是利用除氧铜柱来制备高纯氮，并用高纯氮驱除小环境中的空气，使培养基的配制、分装、灭菌和贮存，以及菌种的接种、培养、观察、分离、移种和保藏等过程始终处于高度无氧条件下，从而保证了这类严格厌氧菌的存活。用这种方法制备成的培养基称为预
5、还原无氧灭菌培养基（PRAS培养基，pre-reducedanaerobicallysterilizedmedium）。在进行产甲烷菌等严格厌氧菌的分离时，可用Hungate的“无氧操作”把菌液稀释，并接种到融化后的PRAS琼脂培养基中，然后将此试管（图7-13）用丁基橡胶塞严密塞住后平放，置冰浴中均匀滚动，使含菌培养基布满在试管的内表面上，犹如好氧菌在培养皿平板表面一样，最后长出许多单菌落（4）厌氧罐（anaerobic jar ）这是一种常规的但不很严格的厌氧菌培养技术，原因是它除能保证厌氧菌在培养过程中处于良好的无氧环境外，无法使培养基配制、接种、观察、分离、保藏等操作也不接触氧气。对厌
6、氧罐反复抽真空、对厌氧罐反复抽真空、 灌氮气，最后灌混合灌氮气，最后灌混合 气体气体 N2:CO2:H2 80:10:10（V/V），剩剩 余氧在钯催化剂的催化余氧在钯催化剂的催化 下，与灌入混合气体中下，与灌入混合气体中 的氢气还原成水而除去，的氢气还原成水而除去， 从而形成良好的无氧环从而形成良好的无氧环 境。境。一般方法国际上盛行方便的“Gaspak”内源性产气袋方法方法：把“Gaspak”内源产气 袋剪去一角并注入适量水后投入 厌氧罐，并立即封闭罐盖，它就 会自动缓缓放出足够的CO2和H2 。“GasPak”内源性产气 袋 产H2反应： NaBH42H2O NaBO24H2硼氢化钠产C
7、O2反应： 柠檬酸3NaHCO3 柠檬酸钠3CO23H2O 加水（国际上盛行方法）（5）厌氧手套箱（anaerobic glove box）箱内始终充满成分为N2:CO2:H285:5:10（V/V）的隋性气体，并有钯催化剂保证箱内处于高度无氧状态。通过塑料手套进行操作。 Anaerobic Glove Box大多数微生物都是好氧菌，微生物一般只能利用溶于水中的氧，要保证在培养液中始终有较高的溶解氧浓度。（二）液体培养法1.好氧菌的液体培养一般情况下（1大气压， 20 ）下，氧在水中的溶解度仅为6.2mlL（0.28mmol），这些氧只能保证氧化8.3mg（即0.046mmol）葡萄糖，仅相当
8、培养基中常用葡萄糖浓度的1。氧的供应始终是好氧菌生长、繁殖中的限制因子。一般可通过增加液体与氧的接触面积或提高氧分压来提高溶氧速率，具体措施有： 浅层液体静止培养； 将三角瓶内培养物利用往复式或旋转式摇床（shaker）作摇瓶培养（shake-flask cultivation）； 在深层液体培养器的底部通入加压空气，并用气体分布器使其均匀、密集的微小气泡； 对培养液进行机械搅拌，并在培养器的壁上设置阻挡装置等。（4）台式发酵罐（benchtop fermentor）（1）试管液体培养（2）三角瓶浅层液体培养（3）摇瓶培养实验室中常用的好氧菌培养法（1）试管液体培养装液量可多可少。此法的通气效
9、果不够理想，仅适合培养兼性厌氧菌。（2）三角瓶浅层液体培养在静止状态下，三角瓶内的通气状况与其中装液量和棉塞通气程度对微生物的生长速度和生长量有很大的关系。此法一般也仅适宜培养兼性厌氧菌。（3）摇瓶培养又称振荡培养，一般将三角瓶内培养液的瓶口用8层纱布包扎，以利通气和防止杂菌污染，同时减少瓶内装液量，把它放到往复式或旋转式摇床上作有节奏的振荡，以达到提高溶氧量的目的。此法是荷兰的A. J. Kluyver等在1933年最早试用，目前广泛地用于菌种的筛选以及进行生理、生化发酵和生命科许多领域的研究工作。（4）台式发酵罐（benchtop fermentor）这是一种利用现代高科技制成的实验室研究
10、用的发酵罐，体积一般为数升至数十升，有良好的通气、搅拌及其他各种必要装置，并有多种传感器（sensor）、自动记录和用计算机的调控装置。现成的商品种类很多，应用较为方便。2.厌氧菌的液体培养实验室中对厌氧菌进行液体培养时，保证培养基的氧化还原电位（Eh）降至-150mV-420mV ，以适合严格厌氧菌的生长。厌氧罐或厌氧手套箱液体培养厌氧菌不必提供额外的培养措施单独放在有氧环境下培养有机还原剂加入能显著降低氧化还原电位的铁丝等巯基乙酸、半胱氨酸、维生素C或庖肉等加 入无机还原剂用深层培养或同时在液面上封一层石蜡油或凡士林-石蜡油二、生产实践中培养微生物的装置（一）固态培养法1.好氧菌的曲法培养
11、原始的曲法培养就是将麸皮、碎麦或豆饼等固态基质经蒸煮和自然接种后，薄薄的铺在培养容器表面，使微生物既可获得充足的氧气，又可利于散发热量，对真菌来说，还十分有利于产生大量孢子。曲（qu或mouldy bran）根据制曲的容器形状和规模的大小分类瓶曲袋曲（用塑料袋制曲）盘曲（用木盘制曲）帘子曲（用竹帘子制曲）转鼓曲（用大型木质空心转鼓横向转动制曲）通风曲（厚层制曲）机械化程度和生产效率较高的现代化制曲技术，酱油酿造业广泛使用。食用菌制种和培养好氧菌的曲法培养瓶曲袋曲 盘曲通风曲一般是由一个面积在10m2左右的水泥曲槽组成，槽上有曲架和用适当材料编织成的筛板，其上可摊一层约30cm厚的曲料，曲架下部
12、不断通低温、湿润的新鲜过滤空气，制备半无菌状态的固体曲。通风曲（厚层制曲）挂曲小 曲红 曲近代人工踏制大曲A whole process of DA-QU prepation2.厌氧菌的堆积培养法生产实践上对厌氧菌进行大规模固体培养的例子还不多见。在白酒生产中，一向用大型深层地窖对固态发酵料进行堆积式固态发酵，这对酵母菌的酒精发酵和己酸菌的己酸发酵等都十分有利，可生产名优大曲酒（蒸馏白酒）。（二）液体培养法1.好氧菌的培养（1）浅盘培养（shallow pan cultivation）（2）深层液体通气培养（1）浅盘培养（shallow pan cultivation）这是一种用大型的盘子对好
13、氧菌进行浅层液体静止培养的方法。在早期青霉素和柠檬酸等发酵中，均使用过浅盘培养。缺点：劳动强度大、生产效率低和产品易污染等，难以推广。（2）深层液体通气培养这是一类应用大型发酵罐进行深层液体通气搅拌的培养技术，它的发明在微生物培养技术发展史上具有革命性的意义，并成为现代发酵工业的标志。发酵罐（fermenter或fermentor）是一种最常规的生物反应器（bioreactor），一般是钢质圆筒形直立容器，其底和盖为扁球形的，高与直径之比一般为122.5。容积可大可小，大型发酵罐的容积在50500m3，最大的为英国用于甲醇蛋白生产的巨型发酵罐，其有效容积达1500m3。发酵罐的主要作用是要为微生物提供丰富而均匀的养料，良好的通气和搅拌，适宜的温度和酸碱度，并能确保防止杂菌的污染。为此，除了罐体有合理的结构（图7-17）外，还要有一套必要的附属装置，例如培养基配制系统，蒸气灭菌系统，空气压缩和过滤系统，以及发酵产物的后处理系统俗称“下游工程”（down-streamprocessing）等。fermenter
