烟草及烟草制品西柏烷二萜醇的测定

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1、烟草及烟草制品西柏烷二萜醇的测定气相色谱 -质谱联用法研究报告项目组2012 年 7 月烟草及烟草制品西柏烷二萜醇的测定气相色谱 -质谱联用法1 概 述烟叶的吃味品质主要受化学成分、物理性状等因素影响，其中化学成分作为物质基础是决定性因素。多年来，烟草化学家试图从烟草化学成分含量及其相互关系得到评价烟草品质的客观指标，如还原糖、总糖、烟碱、总氮、淀粉、石油醚提取物等常规指标。人们对烟叶香味成分和致香前体物质的研究发现，与常规化学成分相比，烟草表面物质包括二萜、糖酯等组分的含量对烟草香味品质具有更重要作用。洗涤去除烟叶表面物质后烟叶香味和吃味明显减弱，同时增加了苦涩味。而将烟叶表面物质加回洗涤后

2、的烟叶上，烟叶的香味和吃味即可恢复。西柏烷二萜醇是烟草表面物质的主要成分，文献报道鲜烟叶中西柏烷二萜醇含量占叶面总脂类物质的50%，可占叶鲜重的 0.7%。烟草表面含量较高的西柏烷二萜醇的结构如图 1 所示，化学名分别为()-2,7,11-西柏三烯 -4,6-二醇()-cembrenediol，() CBD)。CBD 和 CBD 为差向异构体， CBD 的绝对构型为 (1S,2E,4S,6R,7E,11E)-2,7,11-西柏三烯 -4,6-二醇， CBD 的绝对构型为 (1S,2E,4R,6R,7E,11E)-2,7,11- 西柏三烯 -4,6-二醇。西柏烷二萜醇在调制、陈化以及燃烧过程中容

3、易发生氧化和降解，产生多种降解产物，如茄酮、茄醇和降茄二酮等，而这些降解产物被认为是非常重要的烟草香味成分。西柏烷二萜醇的含量和烟草的品质被普遍认为成正相关关系。添加有西柏烷二萜醇的卷烟与对照样相比具有可可香味，余味干净，吃味丰满，较高含量的添加可产生轻微的花香韵，较低含量的OHOH H13579 1113151617181920OHOHH135791113151617181920图1 (1) -2, 7, 11-西柏烷三烯 -4, 6-二醇(2) -2, 17, 11-西柏烷三烯 -4, 6-二醇添加则产生淡薄的粉香韵。鉴于西柏烷二萜醇等烟叶表面化合物的重要性，一些分析方法被开发出来用于烟叶

4、表面化合物的检测。其中，气相色谱应用最为广泛。采用的检测器有火焰离子化检测器（FID）和质谱检测器 (MS)。但是 -CBD 和 -CBD 是差向异构体，需要经过衍生化之后才能在色谱柱上分离开，否则，两种异构体会于同一保留时间流出，因此用气相色谱分离 -CBD 和 -CBD通 常 需 要 衍 生 化 处 理 。 目 前 报 道 的 衍 生 化 方 法 主 要 有 两 种 ： 第 一 种 是 以N,O-bis(trimethyl)trifluoroacetamide (BSTFA) 为衍生化试剂，二萜上的活泼氢被三甲基硅取代。第二种是利用丁基硼酸和吡啶于100 C 加热 15min 衍生化 -C

5、BD 和 -CBD， 硼酸的两个羟基与这两种西柏烷二萜的两个羟基脱水反应。2004 年，结合国家局科技项目烟草表面重要二萜类物质与烟草品质特征关系的研究，郑州烟草研究院通过三年的研究工作，对烟草表面化合物进行了全面系统的分析，在国内首次提取了烟草表面二萜类化合物的纯品并采用质谱和核磁共振技术对其结构进行了鉴定；建立了烟草主要表面化合物的定量分析方法，并对烟草表面物质与烟草品质特征的关系进行了研究。在该项目中建立了一种利用GC/MS 技术应用于烟草中两种西柏烷二萜（ -CBD 和 -CBD）分析的 BSTFA 衍生化分析方法。在该项目研究基础上，本项目组对分析方法进行进一步优化、验证，建立了一种

6、测定烟叶表面主要致香物质前体西柏烷二萜醇的可靠方法。2.实验2.1.仪器与试剂HP6890/5973 型气相色谱质谱联用仪；色谱柱：DB-5 MS 柱，规格为30m 0.25mm 0.25 m；二氯甲烷（分析纯） ；二甲基甲酰胺 (DMF，分析纯）；正十七烷醇，N,O-双三甲基三氟乙酰胺 (BSTFA) (美国 Acros Organics 公司，纯度 98%)、 -2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇(自制，纯度 97%)、 -2,7,11-西柏三烯 -4,6-二醇(自制，纯度 95%)。2.2 溶液配制2.2.1 内标溶液的配制准确称取约 250mg 正十七烷醇到 50mL 的容量瓶中，用

7、二氯甲烷稀释至刻度，该溶液为内标溶液。2.2.2 -CBD 和 -CBD 标准溶液的配制分别准确称量约 30mg -CBD 和 10mg 的 -CBD 置于 10mL 棕色容量瓶中， 加入二氯甲烷溶解并稀释至刻度，该溶液为储备液。分别准确移取 40 L、100 L 、200 L、400 L、800 L、1600 L 的储备液至 10mL 棕色容量瓶中，再准确加入200 L 内标储备液，稀释至刻度，此六个标准溶液为系列标准溶液。2.2.3 提取溶液配制准确移取 2.00mL 内标储备溶液至1000mL 容量瓶中，用二氯甲烷稀释至刻度，得到提取溶液。2.3 样品处理和分析2.3.1 样品处理准确称

8、取 0.5g 烟末(精确至 0.001g)，置于 100mL 锥形瓶中，加入 50mL 提取溶液，超声振荡 10min 后， 用装有 5g无水硫酸钠的滤纸滤去烟末。 取 10mL 滤液至浓缩瓶中，在 500mba，40的条件下浓缩去除溶剂。加入1000L 1:1 (v/v) BSTFA :DMF，洗涤浓缩瓶器壁，将所得溶液转入色谱瓶。在75水浴中进行衍生化反应60min，得到 GC/MS 分析样品溶液。2.3.2 气相色谱 -质谱条件进样口温度： 250；电离方式： EI；离子源温度： 230；传输线温度： 280；进样量： 1 L；分流进样，分流比： 10:1；载气：氦气，恒流模式，流量1m

9、L/min；程序升温：初始温度 150，以20/ min的速率升温至 215，再以0.5/ min的速率升至220，最后以 10/ min的速率升至 290，在290后运行 20min。扫描方式：选择离子监测（SIM）；选择离子：内标离子m/z=313；萜醇和 萜醇离子 m/z=169。每个离子的监测时间为 50ms。3. 结果与讨论3.1 烟草中主要二萜和蔗糖酯的定性由于标准质谱库中没有衍生后的 -CBD 和 -CBD 的标准谱图，通过与纯品的保留时间和 MS 谱图比较对烟草样品中 -CBD 和 -CBD 进行定性确认。图 1 -CBD 和 -CBD 衍生后的总离子流图（1. -CBD 2.

10、 -CBD ）图 2 烟草样品的总离子流图图 1 为 -CBD 和 -CBD 标准样品衍生后的总离子流色谱图，在10.69 和 11.81min 两处的色谱峰分别是 -CBD 和 -CBD。图 2 为烟草样品的总离子流色谱图，可以看出烟草样品在10.69和11.81min处也存在两个典型的色谱峰。5 01 0 01 5 02 0 02 5 03 0 03 5 040 04 5 005 0 0 0 01 0 0 0 0 01 5 0 0 0 02 0 0 0 0 02 5 0 0 0 03 0 0 0 0 03 5 0 0 0 04 0 0 0 0 04 5 0 0 0 0m /z - - A

11、b u nd a n c eS c a n 6 5 6 ( 1 0.71 5 mi n ) : 4.D 7 31 6 91 4 32 31 21 111 7 9 34 3 2 6 91 9 131 73 6 04 3 52 9 24 0 72 5 03 3 93 8 1图 3 -CBD 标准品 (衍生化 )质谱图5 01 0 01 5 02 0 02 5 03 003 5 04 0 04 5 001 0 00 0 02 0 00 0 03 0 00 0 04 0 00 0 05 0 00 0 06 0 00 0 07 0 00 0 08 0 00 0 0m /z - - A b u n d a

12、 n c eS c a n 6 5 3 ( 1 0.68 9 m in ) : 1 - 1.D 7 31 6 91 4 32 3 1 2 111 1 7934 3 2 6 91 9 13 6 03 1 74 3 52 9 24 0 72 5 03 3 93 8 1图 4 烟草样品10.7 min 处的质谱图501001502002503003504004500100000200000300000400000500000600000700000800000900000100000011000001200000m/z- - AbundanceScan782( 11. 798mi n) :6. D

13、731692311432111174393 317191360265291407435339380图 5 -CBD 标准品 (衍生化 )质谱图501 0015020 02503003504004 50020000400006000080000100000120000140000160000180000200000220000240000260000280000m/ z- - Abu nd anceScan783( 11. 8 07mi n) :1- 1 . D 73169231 14321111 74393 3 1719136 0265 29143540 73393 80图 6 烟草样品11.

14、8min 处的质谱图图 3 为 -CBD 标准品衍生化后的质谱图， 图 4 为烟草样品相同保留时间 （10.7min）色谱峰的质谱图。由质谱图可以看出，二者的主要碎片离子和相对丰度高度一致，可以认为烟草样品色谱图中 10.7min 处的色谱峰为 -CBD 的衍生物。同样，图 5 为 -CBD 标准品衍生化后的质谱图，图 6 为烟草样品相同保留时间（10.8 min）色谱峰的质谱图，二者的主要碎片离子和相对丰度高度一致，可以认为烟草样品色谱图中11.8min 处的色谱峰为 -CBD 的衍生物。3.2 样品处理条件优化3.2.1 衍生化条件的选择3.2.1.1衍生化介质的选择衍生化介质是衍生化反应

15、的的外部环境，衍生化介质必须要对衍生化试剂和被衍生化物质具有良好的溶解性，因此衍生化介质的选择直接关系到衍生化反应的进行。结合文献报道，选用二甲基甲酰胺、三氯甲烷和甲苯3 种衍生化介质进行比较，结果如表1：表 1 不同衍生化介质对衍生化反应的影响a目标物三氯甲烷二甲基甲酰胺甲苯 -CBD 1.031 1.892 0.238 -CBD 0.066 0.566 0.062 注：a表中数据为目标化合物与内标峰面积之比，下同。表 1 结果表明，不同的衍生化介质对衍生化效果影响较大。在选择的三种介质中，二甲基甲酰胺的衍生化效果要明显好于三氯甲烷和甲苯。因此，本实验选二甲基甲酰胺作为衍生化的介质。3.2.

16、1.2 衍生化介质与衍生化试剂比例的选择一般情况下， 加入的衍生化试剂的量越大衍生化效果越好。固定衍生化介质与衍生化试剂的总体积为 1000L ，改变两者的量得到不同衍生化介质与衍生化试剂的比例。考察了35:15、30:20、25:25 和 20:30(v/v)对衍生化反应的影响，结果如表2：表 2 不同衍生化介质与衍生化试剂的比例(v/v)对衍生化反应的影响目标物35:15 30:20 25:25 20:30 -CBD 1.472 1.490 1.792 1.788 -CBD 0.417 0.428 0.526 0.515 由表 2 可以看出，随着衍生化介质与衍生化试剂比例的减小，衍生化的效果逐渐变好。综合考虑两种目标物的衍生化效果，当两者的比例为25:25 时，衍生化效果最好。因此，本实验选衍生化介