【生物技术】第二讲 植物组培的培养基

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1、第二讲 培养基目的要求：一、掌握培养基的种类及其特点三、掌握培养基的组成和其适宜剂量二、掌握MS培养基配制四、理解培养基筛选方法第一节 培养基的种类和成分 一、培养基种类 二、培养基成分 第二节 培养基制备 一、母液配制和保存 二、培养基配制、分装和灭菌第三节 培养基的选择一、单因子试验 二、多因子试验三、逐步增减法 四、广谱实验法一、培养基的种类 1、根据其态相不同分为固体培养基与液体培养 基。固体培养基是指加凝固剂的培养基。培养基中加入一定量的凝固剂，加热溶解后 ，分别装入常用的培养容器中冷却后即得到固体 培养基。 液体培养基是指不加凝固剂的培养基。 培养基种类固体培养基液体培养基营养分布

2、均匀，生 长整齐一致，但通 气性差。通气性较好，便于操作 ，但营养分布不均，生 长发育不整齐。二者比较2、根据培养物的培养过程培养基分为：初代培养基和继代培养基 外植体：从植物体上取出的用于无菌培养的植物 材料。植物材料：茎尖、茎段、花瓣、叶子、花药等 初代培养 ：指用来第一次接种从植物体 上分离下来的外植体过程 。 继代培养：对培养物(包括细胞、组织或 其切段)通过更换新鲜培养基及不断切割 或分离，进行连续多代的培养，就称为继 代培养。3、根据其作用不同，培养基分为：诱导培养基 增殖培养基生根培养基 4、根据其营养水平不同，培养基可分为基本培养基 和完全培养基。基本培养基（就是通常称呼的培养

3、基）主要有MS、 White、 N6、B5 、改良MS、Heller、Nitsh、SH、 Miller等。完全培养基就是基本培养基的基础上，根据试验的 不同需要，附加一些物质，如生长调节物质和其他复杂有 机物质等。常用培养基种类MS培养基 B5培养基White培养基N6培养基KM-8P培养基有机成分复杂，它包括了所有的单糖和维 生素 用于原生质体培养( 包括原生质融合的培 养)KM-8P培养基特点：N6培养基特点： 1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物 花药培养而设计 成分简单 KNO3 和 (NH4)2SO4含量高 广泛应用于小麦、水稻及其它植物的 花药培养等 White培养基特点： 194

4、3年由hite为培养番茄根尖而设计的 。1963年又作了改良，称作hite改良培 养基 。 特点：无机盐含量较低 适用：生根培养。B5培养基特点： 含较低的铵 双子叶植物 尤其木本植物组培 可选择MS培养基特点：无机盐、离子浓度高，硝酸 盐含量较高。 MS培养基是目前应用最多最普遍的培养基。无机盐的浓 度较高，能保证组织培生长所需的矿物质营养。并且因 为离子浓度高，在配制、贮存、消毒过程中，即使有些 成分略有出入，也不致影响培养基中的离子平衡 二、 培养基成分水植物激素无机盐有机物培养体支持材料 辅助性物质一、无 机 盐 氮 枝叶生长需要氮素，缺氮老叶先发黄 ；氮过量，枝叶过度茂盛 。 磷 缺

5、磷，植株生长缓慢，老叶暗紫色。 钾 促进花卉生长健壮，增强抗性，茎秆 挺拔。缺钾，叶尖、叶缘枯焦，叶片呈 皱曲状，老叶发黄或火烧状。 钴 缺钴，叶片失绿而卷曲，整个叶片向 上弯曲凋枯。二 、 有 机 物维 生 素肌 醇氨 基 酸天然复合物椰子汁（CM）酵母浸出液（YE)水解酪蛋白（CH)碳水化合物马铃薯汁液其 它碳水化合物 选用种类：蔗糖（或葡萄糖、果糖）等 蔗糖浓度：2%3%，胚培养为4%15% 大生产时可用白糖糖在培养基的作用： 1）为细胞提供合成新物质的碳骨架 2）为细胞的呼吸代谢提供底物和能量 3）维持渗透压种类： VB1（盐酸硫胺素）、VB6（盐酸吡哆醇 ）、 VB3（烟酸）、Vc（

6、抗坏血酸 浓度：0.11.0mg/L 作用：VB1 促愈伤组织产生，提高活力VB6 促根生长 Vc 防组织褐变VB3 与植物代谢和胚的发育有关系 维 生 素氨基酸：甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬 氨酸、 天冬酰胺、丙氨酸等等。因培养基的种类不 同，其种类和浓度不同。 肌醇：又称环己六醇，在糖类的转化中起作用名称分子量溶解性质性质蔗糖342.30溶于水、乙醇无变旋现象山梨糖180.16溶于水甜味与蔗糖相似葡萄糖180.16溶于水有变旋现象，以游离态或磷酯 形式存在果糖180.16溶于水、乙醇有变旋现象，甜度高于蔗糖盐酸硫胺素（VB1）337.28溶于水、乙醇、甘 油受高温影响小，可高温消

7、毒核黄素（VB2）376.37溶于无水乙醇、微 溶于水等电点PH=6.0，碱性溶液中易 变质，光能加速变质盐酸吡哆素（VB6）205.64溶于水、乙醇对光、空气、热稳定是转氨酶 的辅酶钴胺素（VB12）1355.42溶于水、乙醇受高温影响小，可高温消毒， 参与丝氨酸转变为甘氨酸过程烟酸（VPP）123.11极易溶于水、乙醇对空气、光、热、PH值稳定生物素（VH）244.31溶于水、乙醇对空气温度稳定叶酸（VM）441.40易溶于乙酸、NaOH 、微溶于水参与生物甲基化作用抗坏血酸（VC）176.12极易溶于水有较强的还原能力，可做抗氧 化剂用，参与酪氨酸代谢及色 氨酸的羟基化作用肌醇180.1

8、6易溶于水植物中广泛存在，可能与 IAA的代谢有关常见糖和维生素及其主要性质椰乳：促愈伤组织和细胞培养，用量1020%， 使用注意茎尖大小香蕉泥：用量150 200ml/L ，应用在兰花组培马铃薯汁液：用量150200g/L，使苗壮水解酪蛋白：浓度100200mg/L，应用在微茎尖 培养天然复合物自然界中，植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它 能以极微小的量影响到植物的细胞分化、生长、发育，影响到植物 的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠、萌发等许多 生理生化活动。 在培养基中，其各种成分对培养物影响最大的最显著的就是激素 。激素的种类、浓度、以及配比都会显著的影响愈伤组织的

9、形成、 不定根、不定芽的分化，胚状体的形成等。 通常，不同植物，或不同品种，甚至同一植物的不同位置对激素 的要求有很大的变化，这主要取决于植物的内源激素水平。 组织培养中使用的激素有的是天然的，如脱落酸（ABA）等，有 的是合成的，如二氯苯氧乙酸（2，4D）三、激素（一）、激素的种类： 1、生长素类： 在自然界中，生长素影响茎和节间的伸长、 向性、顶端优势、叶片脱落和生根等现象 在组织培养中的主要作用是：诱导细胞的分 裂和根的分化，诱导愈伤组织）组织培养中常用的生长素： 1 二氯苯氧乙酸（2，4D） 2 萘乙酸（NAA） 3 吲哚乙酸（IAA） 4 吲哚3丁酸（IBA） NAA、IAA、IBA

10、被广泛用于生根，2，4D有 利于愈伤组织的诱导和生长。IAA容易光解，注意用棕色试剂瓶保存，保存 时间不要太久。 溶解方法：1M NaOH或95酒精，以前者为好 保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存2、细胞分裂素 自然界中，细胞分裂素影响细胞分裂，顶端优势的变化和茎的 分化等 组织培养中，细胞分类素主要促进细胞分裂和由愈伤组织上或 器官上分化不定芽。细胞分裂素常常与生长素相互配合，用以调节 细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成。 常用的细胞分裂素有： 6苄氨基嘌呤（6BA） 激动素（6-糠氨基嘌呤、 KT） 玉米素（ZT） 噻二唑苯基脲（ thidiazuron、 TDZ ） 溶解方法：1MH

11、CL 保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存3、赤霉素 由日本人黑泽1926年发现。自然界中，赤霉素能够打破休眠、 促进果实成长等效果。虽然已经用于顶端分生组织的培养和维管分 化的研究，但在培养基中很少添加，因为它的作用往往是负面的。 虽然也有赤霉素能刺激不定胚发育成正常小植株的报道，但在使用 中仍需慎重，不可轻易添加。 赤霉素有20多种，其中在组织培养中最常用的是GA3。在组织培 养中与生长素和细胞分裂素相比，赤霉素不太常用，据报道赤霉素 能刺激不定胚正常发育成小植株 溶解方法：95酒精 保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存 赤霉素易溶于水，但溶于水后不稳定，容易分解 灭菌：高温易分解，要过滤灭菌

12、4、脱落酸 在自然界中，脱落酸能阻碍发育、促进老化、 形成休眠芽等作用。 经试验表明，脱落酸有利于胚性愈伤组织形成 正常不定芽。 材料的试管保存，加上脱落酸能抑制生长，使继 代培养时间延长。 溶解：易溶于NaHCO3溶液、氯仿或丙酮。 保存：具有热稳定性，但容易发生光解。配成一定浓度后，冰箱冷藏保存（二）、常见培养基中植物激素配方类型激 素 配 方 再生方式及用途 1.无植物激素诱导生根、无性胚、愈伤组织形成2.单加生长素诱导生根、愈伤组织、无性胚、不定芽3.单加细胞分裂素诱导不定芽、侧芽增殖、愈伤组织形成4.高生长素低细胞分裂素诱导芽、原球茎增殖、愈伤组织形成5.低生长素高细胞分裂素诱导丛芽

13、、愈伤组织形成6.低生长素低细胞分裂素诱导不定芽、侧芽增殖7.等量生长素与细胞分裂素诱导侧芽增殖8.加生长抑制剂（多效唑、矮壮素等）壮苗、延缓生长、利于试管苗保存9.加GA3打破种子、芽休眠，促进伸长生长名称 分子量 溶解性质 主要作用吲哚乙酸（ IAA）175.19易溶于热水、乙醇、 乙醚、丙酮促进细胞的延伸生 长和细胞壁结构的 松驰，也可用于诱 导生根吲哚丁酸 (IBA)203.24溶于醇、丙酮、醚稀 碱、稀酸液为生根刺激剂a-萘乙酸 (NAA)186.20 易溶于热水、丙酮、 醚、乙酸、稀碱液促进细胞生长，刺 激生根2,4-二氯苯 氧乙酸(2,4- D)221.04易溶于醇、丙酮、乙 醇

14、、稀碱液促进愈伤组织形成 赤霉酸 (GA3)346.38易溶于醇、乙酸乙酯 、碳酸氢钠和醋酸钠 的水溶液，其钠促进茎、叶伸长生 长，打破休眠 （三）、常见生长调节剂及主要性能一览表（四）、常见生长调节剂的微摩尔/升浓度与毫克/升的换微摩 尔/升毫克/升IAAIBANAA2,4-DKTBA2iPZTTDZGA310.1750.203 20.186 20.22100.21520.22530.20270.21900.22020.346420.35040.406 40.372 40.44210.43040.45050.40540.43800.44040.692730.52550.609 40.558

15、60.66310.64560.67580.60810.65700.66061.039140.70070.812 80.744 80.88420.86080.90100.81080.87600.88081.385550.87591.016 00.931 01.10521.07611.12631.01351.09501.10101.731961.05111.219 21.117 21.32621.29131.35161.21621.31401.32122.078271.22631.422 41.303 41.54731.50651.57681.41891.53301.54142.424681.40141.625 61.489 61.76831.72171.80211.62161.75201.76162.771091.57661.828 81.675 81.98941.93692.02731.82431.97101.98183.1173四、培养体支持材料 1.琼脂 用量710g/L（0.7%-1%） 注意：1 若浓度过高，培养基就会变得很硬，营养物质就难于扩 散到培养的组织中。2