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1、（二）、吸附柱色谱操作技 术n 吸附柱色谱的制备n 上样n 洗脱1、吸附柱色谱的制备（1）层析柱的选择层析柱一般使用下端带有活塞的玻璃管， 柱 的直径与高度比为1:1040，柱的大小一般以 能 装样品的3050倍量的吸附剂（通常为100目 左 右）为好。（2）装柱先将空色谱柱清洗干净，干燥后在色谱柱 管底部铺一层脱脂棉，再加一层厚约0.5cm的石 英砂，然后选择具体的方法。1）干法装柱：直接用小漏斗将吸附剂均匀 装入柱内的方法；2）湿法装柱：将吸附剂装入盛有洗脱液的 柱内，或将吸附剂与适量的洗脱剂混合成混悬 液 均匀装入柱内的方法。（3）装柱要点干法装柱时要用橡皮槌轻轻敲打色谱柱，使吸附 剂装
2、填连续、紧密；湿法装柱要连续缓慢地倒入色谱柱内，打开色谱 柱下端活塞，低速放出洗脱剂，使吸附剂慢慢沉 降注意继续补充洗脱液，保持流速，确保液面高 于吸附剂的表面同时轻轻敲打柱壁，至吸附剂沉 降完全。要求柱中吸附剂充填均匀，柱体内不能出 现 空气泡、疏密不均或裂缝。为增强分离效果提高 分离速度可在柱面覆盖一层干净、均匀的细沙 。2、 加样:又称上样或样品上柱。多将样品溶于少量洗脱剂中，小心的加入层 析柱顶端的平面内；也可将样品与易挥发溶剂混 合后，再与吸附剂吸收、挥干挥发性溶剂后，撒 布于柱的上端；有时也可用多层园形滤纸吸收样品溶液，再 平放到柱的上端。柱层析加样的基本要求是均匀薄饼样层（体积
3、小浓度高）。上样量为吸附剂的1/601/30 。3、 洗脱：洗脱操作的目的是要将加入的样品中各 个组分先后从上往下带出来，并能分开收集 各成分。洗脱的过程中，上端溶剂不能干，分段 收集是关键；作定性检查合并相同成分。TLC时Rf为0.20.3的溶剂系统是最佳的 洗脱系统，梯度洗脱。4. 应用 柱色谱分离能力比薄层分离能力更强，效果更好，尤其对结构相似、性质接近 、采用薄层难以分离的成分分离效果好。（三）聚酰胺色谱操作1.制备 （1）含义 （2）类型 薄层色谱、柱色谱 （3）制备薄层色谱 购买预制品柱色谱 湿法装柱，将聚酰胺粉用水浸泡 1h后，搅匀装柱。聚酰胺柱色谱分离成分时， 洗脱液必须以水为
4、基本溶剂进行洗脱。（三）聚酰胺色谱操作2、聚酰胺 色谱的分离原理酰胺键与被分离物质质的氢键氢键 作用是聚酰酰 胺吸附作用的主要原因。聚酰胺吸附力的影响因素： 1:形成氢键的能力与溶剂有关水中有机溶剂中碱性溶剂中 常用溶剂对聚酰胺洗脱能力顺序如下： 水甲醇或乙醇丙酮稀氢氧化钠液或稀氨溶 液甲酰胺或二甲基甲酰胺尿素水溶液。2：化合物分子结构：在含水溶剂中，化合物分 于结构对氢键缔合影响有以下几点： 化合物分子中能形成氢键的基团越多，被聚 酰胺吸附越强。如： 成键基团所处的位置不同，被吸附的强度也不 同。一般间位、对位的吸附力强于邻位的吸附 力。如： 分子中芳香核、共轭双键多者被吸附强度 大，少者则
5、被吸附强度小。如： 能形成分子内氢键者被吸附强度减小。如：n常用于分离黄酮类、酚类、醌类等化合物，分 离效果好。对鞣质的吸附几乎不可逆，则常用 于粗提物中鞣质的除去。小结：柱色谱 步骤：装柱上样洗脱 1、装柱问题1）吸附剂多细？2）方法？3）湿法用什么液体？4）怎么装？100目 干法、湿法洗脱剂 底垫棉顶铺沙干敲湿开洗脱剂、浓 吸附剂的1/601/30 慢、保平2、上样问题1）溶剂是？浓度是？2）量是？3）操作要点？3、洗脱问题1）怎么选？2）用多少？选TLC时Rf为0.20.3的展开剂 保持一定液面高度直至成分全流出4、评价 分离能力比薄层强。5、聚酰胺柱色谱操作与一般柱色区别1）多用湿法装
6、柱。2）溶剂是水。3）洗脱液必须是水溶性溶剂。第三节 分配色谱一、分配色谱原理：分配原理，即在展开过程中，各成分在固定 相(s)和流动相(m)之间作连续不断的分配，由于 各成分在两相间的分配系数不同，因而可以达到 相互分离的目的。以Cs表示某成分在固定相中的浓度，Cm表示某成分在流动相中的浓度。 则 分配系数 KCs/Cm K越大，说明该成分在固定相中的分配浓度越大 ， 反之越小。一般来说，混合物中各成分分配系数 相差越大，越易分离。二、分配色谱基本构成要素n4个基本构成要素：支持剂固定相流动相被分离成分 （一）支持剂（载体）载负固定相的介质。应该具备的基本条件：中性多孔的粉末、 无吸附活性、
7、在洗脱剂之中不溶解；所能够吸 收 固定相的量，最好能达载体本身重量的50%以上 ；能使流动相自由的通过载体所吸收的固定相 ， 并且不影响溶剂系统的组成和性质。能够满足这些条件的载体：硅胶：含水17%。吸水量50以上硅藻土：惰性多用。吸水量100纤维素：惰性，常用。（二）固定相1、种类：极性和亲水性溶剂：一般为水及各种水溶液 （酸、碱、盐与缓冲液）、甲酰胺、低级醇（亲 水性）等。亲脂性溶剂：硅油、液体石蜡、石油醚等。2、选用原则：分离亲水性成分，选用极性和亲水性溶剂为 固定相。分离亲脂性成分，选用亲脂性溶剂为固定相 。（三）流动相亲脂性溶剂：石油醚、苯、卤代烷类、脂类、酮 类（如丁酮）、醇类（丁
8、醇、戊醇）等或者它们 的混合物。 极性和亲水性溶剂：水、水溶液、与水互溶的有 机溶剂。选用原则（与固定相互不相溶）：分离亲水性成分，选用亲脂性溶剂为流动相 。分离亲脂性成分，选用极性和亲水性溶剂为 流动相。（四）被分离成分n被分离成分极性大，则选用极性大的固定 相和极性小的流动相；被分离成分极性小，则选用极性小的固定 相和极性大的流动相。 （使K大）三、分配色谱的类型1、按形式分：纸色谱、薄层色谱、柱色谱。2、按相的极性分：正相色谱、反相色谱 正相色谱：固定相的极性大于流动相的极性，则 极性小的成分先被展开或洗脱。常用于分离极性 较大的成分 反相色谱：固定相的极性小于流动相的极性，则 极性大的
9、成分先被展开或洗脱。常用于分离极性 小的脂溶性化合物 四、分配色谱的技术操作n纸色谱n分配薄层色谱n分配柱色谱（一）纸色谱n含义以滤纸纤维为惰性载体的平面分配色谱。n纸色谱的主要组成u支持剂：滤纸纤维u固定相：滤纸纤维中所含的水分。通常可含有20% 25%。u流动相：常用的是含水的有机溶剂，如水饱和的 正丁醇、正戊醇等。平面色谱中又叫展开剂。n操作（1） 滤纸的选择：常用层析专用滤纸，纯净 无杂质，有一定强度；同时还须质地均匀、 平整无折痕，根据样品及展开剂的要求来选 择下列各型滤纸：快速滤纸结构巯松，宜用来分离Rf值相 差较大的成分。慢速滤纸结构致密，宜用来分离Rf值相 差较小的成分。中速滤
10、纸比较常用 2）操作点样：注意常规距离：板端留2cm、样点之 间 留2cm。展开：层析所用容器与TLC基本相同，专用 纸谱筒或大试管也被常用。显色：干燥后的滤纸，采用先看（日光下 看）、再照（紫外灯下照）、再喷（需要时喷 上 显色剂）的步骤进行显色。不能用有腐蚀性的 显 色剂。Rf值的计算方法与薄层层析相同 PC:成分极性大小与Rf值的关系若流动相极性小于水，称正相色谱。则 成分极性越大，在水中分配越多（即纸上 分配越多），Rf值越小（成反比关系，同 TLC） 若流动相极性大于水，称反相色谱。则 成分极性越大，在流动相中分配越多，Rf 值越大（成正比关系）纸色谱一般均为正相色谱（3）滤纸层析分
11、离氨基酸层析时，将样品点在滤纸的一个角上，称为原点。然后将其放入一个密闭的容器 中，用一种溶剂系统进行展层，层析后烘干滤纸，再将其旋转90度采用第二种溶 剂系统进行第二相展层。由于各种氨基酸在两个不同的溶剂系统中具有不同的迁 移率（ Rf ），因此它们就会彼此分开，当用茚三酮显色时，就会在滤纸上面出现 各种氨基酸的斑点。当然，若氨基酸种类较少或一相就能分开，进行一相层析即 可。 溶剂 前沿氨基酸 显色点滤纸 原点XY滤纸层析中的Rf值， Rf =X/Y丁醇-醋酸酚-甲酚-水氨基酸的双向滤纸层析图谱纸色谱应用n纸色谱广泛应用于化合物的分离和鉴定 。对亲水性和弱亲脂性成分的分离用纸 色谱效果比薄层
12、色谱更好。分离亲水性 和亲脂性成分用正相色谱。 （二）分配薄层色谱1、含义 以硅胶或硅藻土作为支持剂的分配层析 法 2、组成 支持剂：硅胶或硅藻土固定相：水流动相：有机溶剂3、操作 除了铺板有所区别，同时薄层板不需活 化外，其他操作均与吸附薄层色谱相同。（三）分配柱色谱1、含义 将吸附有固定液的载体装入色谱柱2、组成 支持剂：含水17%以上的硅胶、硅藻 土（加压柱色谱中所用的载体颗粒直径更小 ，小于常压柱色谱中所用载体颗粒直径的10 倍以上。）固定相：水流动相：含水的有机溶剂3、类型 A：快速、低压、中压、高压B：正相、反相4、操作 装柱：湿法装柱上样、洗脱：流动相须先用固定相饱和收集、检查吸附柱色谱分配柱色谱
