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1、DNA的损伤原因：1.DNA分子的自发性损伤(1) DNA复制中的错误(2) DNA的自发性化学变化a.碱基的异构互变b.碱基的脱氨基作用c.脱嘌呤与脱嘧啶d.碱基修饰与链断裂2.物理因素引起的DNA损伤(1) 紫外线引起的DNA损伤(2) 电离辐射引起的DNA损伤a.碱基变化b.脱氧核糖变化、c.DNA链断裂d.交联复习3.化学因素引起的DNA损伤(1) 烷化剂对DNA的损伤 a.碱基烷基化b.碱基脱落c.断链d.交联(2)碱基类似物、修饰剂对DNA的损伤复习分子改变类型： 点突变 (point mutation) ： 指 DNA 分子上一个碱基的变异（置换）。 (1)、转换 (transi
2、tion) ：发生在同型碱基之间的置换 (2)、颠换 (transversion) ：发生在异型碱基之间的置换突变效应：同义突变 错义突变 无义突变 终止密码突变 抑制基因突变 移码突变DNA的修复系统(一)回复修复1.光修复2.单链断裂的重接3.碱基的直接插入4.烷基的转移(二)切除修复(excision repair)(三)重组修复(recombinational repair)(四)SOS修复复习1 转座子的分类和结构特征 a. 简单转座子 转座子（transposon，Tn）是存在于染色体DNA上可自主复制和移位 的基本单位。 最简单的转座子不含有任何宿主基因而常被称为插入序列（ins
3、ertion sequence，IS），它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。一 个细菌细胞常带有少于10个IS序列。转座子常常被定位到特定的基因中 ，造成该基因突变。IS序列都是可以独立存在的单元，带有介导自身移 动的蛋白。 b.复合式转座子（composite transposon）是一类带有某些抗药性基因 （或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS 序列，表明IS序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子。 一旦形成复合转座子，IS序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修 饰了，只能作为复合体移动。重组与转座2、转座作用的机制转座时发生的插入作用有一个普
4、遍的特征，那就是受体分子中有一段 很短的（3-12bp）、被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。不同转座子的靶序列长度不同，但对 于一个特定的转座子来说，它所复制的靶序列长度都是一样的，如 IS1两翼总有9个碱基对的靶序列，而Tn3两端总有5bp的靶序列。转座可被分为复制性和非复制性两大类。 在复制性转座中，所移动和转位的是原转座子的拷贝。转座酶（ transposase）和解离酶（resolvase）分别作用于原始转座子和复制 转座子。TnA类转座主要是这种形式。在非复制性转座中，原始转座子作为一个可移动的实体直接被移位， IS序列、Mu及Tn5等都以这种方式
5、进行转座。重组与转座转座子的应用3. 反转录转座子(retrotransposon或retroposon)指通过RNA为中介，反转录 成DNA后进行转座的可动元件。这样的转座过程称为反转座作用(retrotransposition)。 4. 转座作用的遗传学效应 转座引起插入突变; 转座产生新的基因; 转座产生的染色体畸变; 转 座引起的生物进化.目前转座子元件是植物分子生物学操作和植物基因工程中分离克隆基因和研 究基因功能最有力的工具之一，其中的一大类反转录转座子具有分布广、异源转座高和受组织培养诱导激活等优势。此外通过对现有转座元件的改造以及转座元件作为载体改造的工具，也将大 大加速植物基
6、因和功能序列的分离与研究，如利用转座子元件构建启动子。第七章 基因操作与克隆载体一、DNA体外重组的基本含义二、限制性内切酶 三、DNA体外重组常用的工具酶四、常用的载体一、DNA重组技术的基本含义1、基本概念 DNA重组技术也称为基因克隆或分子克隆。最终 目的是把一个生物体中的遗传信息（DNA）转入另一个生物体。 2、基本步骤 目的基因的提取:供体生物基因或称外源基因的提取 限制性酶切：目的基因切成不同大小的片段 连接：连接到另一DNA分子上（克隆载体） 转化:将这个重组DNA分子转入受体细胞 筛选和鉴定:对吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定 基因表达：进行培养，检测外援基因是否表达二
7、、限制性内切酶1、限制性内切酶的定义 是指已被证明是限制修饰系统中的一个组成部分，具 有识别双链DNA分子中的某种特定核酸序列并由此切 割DNA双链结构的酶统称为限制性内切酶。2、限制性内切酶的发现 Luria和Human发现细菌能将外来的DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不被外来噬菌体所感染， 而其自身的DNA由于被一种特殊的酶所修饰（甲基化）而得以保护，这种现象叫做限制修饰。二、限制性内切酶Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种酶，能够特 异性的切割DNA，这个酶被命名为Hind I,这是第一个分 离到的限制性内切核酸酶。二、限制性内切酶二、限制性内切酶3、限制性核酸内
8、切酶的命名 按酶来源菌的属、种名而定，取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母 作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其 后再按发现的先后写上罗马数字。例如：从流 感嗜血杆菌d株（Haemophilus influenzae d） 中先后分离到3 种限制酶， 则分别命名为 Hind、Hind和Hind。二、限制性内切酶4、限制性内切酶的类型限制性内切酶可分为三大类型： 类型I和类型III ：由于识别位点并非严格专一，很少被应用。 类型II ：是DNA重组技术最为常用的工具酶。类型II 限制性内切酶的特点 识别位点严格专一 识别序列的碱基数一般为4、6、8个bp 识别位点经常是一种
9、回文序列的DNA二、限制性内切酶5、常见的限制性内切酶限制性核酸内切酶名称 识别序列和切割点 EcoR GAATTC Hind GTPyPuAC Hind AAGCTT BsuR I GGCC Pst CTGCAG Sma CCCGGG Xba TCTAGA Xho CTCGAG BamH GGATCC Not GCGGCCGC二、限制性内切酶6、限制性内切酶的切割方式 就切割位点相对于对称轴的位置而言,切割方式 有三种: 在对称轴5 侧切割产生5 粘端 在对称轴3 侧切割产生3 粘端 在对称轴处切割产生平段二、限制性内切酶5 GAATTC-3 EcoRI G AATTC 5 粘端 3 CTT
10、AAG-5 CTTAA G5 CTC GAG-3 Pst I CTCGA G 3 GAG CTC-5 G AGCTC 3 粘端5 CCC GGG-3 Sma I CCC GGG 平末端 3 GGG CCC-5 GGG CCC二、限制性内切酶二、限制性内切酶7、限制酶产生末端的连接a、粘性末端互补 -CTCGAAGCTTGTTC- -GGCAAGCTTACT- -GAGCTTCGAACAAG- -CCGTTCGAATGAHindIII酶解 HindIII酶解 -CTCGA- -AGCTTGTTC- -GGCA- -AGCTTACT- -GAGCTTCGA- -ACAAG- -CCGTTCGA-
11、-ATGA-混合退火-G G C A A G C T T G T T C-C C G T T C G A A C A A G-切口二、限制性内切酶b、不匹配末端连接-AAGCTT- -TCTAGA-TTCGAA- -AGATCTHindIII Xba I-A CTAGA-TTCGA T-Klenow酶填补-AAG CTAGA-TTCGA TCT- A A G C T A G A - T T C G A T C T -Klenow片段（克伦诺片段，Klenow fragment）： E.coli DNA聚合酶I经部分水解生成的C末端605个氨基 酸残基片段。该片段保留了DNA聚合酶I的5-3聚合
12、酶 和3-5外切酶活性，但缺少完整酶的5-3外切酶活性。 它可用于填补DNA单链末端成为双链。 a、用于同位素标记DNA片段末端b、合成cDNA的第二条链c、Sanger双脱氧法进行序列分析d、定位突变二、限制性内切酶二、限制性内切酶c、平末端连接-AAGCCCGGGTCG- -GGAGGTTAACCT-TTCGGGCCCAGC- -CCTCCAATTGGA-SmaI酶切 AAGCCC-OH P-GGGTCG- -GGAGGTT-OH P-AACCT- TTCGGG-P OH-CCCAGC- -CCTCCAA-P OH-TTGGA-混合退火OH P-GGAGGTT GGGTCG-CC TCCA
13、A CCCAGC二、限制性内切酶三、其他常用的工具酶（一）DNA聚合酶 1、大肠杆菌DNA聚合酶I （E.coli DNA pol I)：具有三种酶活性 a、5 3DNA聚合酶活性CCGATA-OH E.coli DNA pol I CCGATAGCCTGGCTATCGGA Mg2+ dNTP GGCTATCGGA b、3 5 外切酶活性CGCATCG-OH E.coli DNA pol I CGC ATCGGCG Mg2+ dNTP GCG c、5 3外切酶活性CGCATTAG E.coli DNA pol I CATTAGGCGTAATC Mg2+ GCGTAATC2、Klenow片段三、其他常用的工具酶3、噬菌体DNA聚合酶 来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，可对3突出端的DNA分子进行末端标记。切除3突出端，产生3凹端。CTGCCTGCA T4DNA CTG CTGCC GACGG 32P GACGG GACGG4、Tag DNA聚合酶 是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，具
