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1、1.2 基因工程的基本操作程序补：原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点启动子终止子RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点， 并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并 以DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚 合酶也从DNA模板链上脱落下来。不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能不能编码蛋白质。编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质 编码区非编码区原核 细胞 的 基因 结构 有有调控调控遗传信息表达的核遗传信息表达的核苷酸苷酸序列序列，在该序列中，在该序列中，最重
2、要的是位于编码区上最重要的是位于编码区上游的游的RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点。非编码区非编码区编码区 编码区上游 编码区下游 启动子终止子补：真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶 结合位点 内含子 外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内 含子启动子终止子编码区上游 编码区下游 内含子： 外显子： 真核 细胞 的 基因 结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。 非编码序列：包括非编码区和内含子编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶 结合位点
3、 内含子 外显子 启动子终止子编码区上游 编码区下游 原核细胞真核细胞 不同点编码区是 _的编码区是间隔的、 _的相同点都由能够编码蛋白质的_和具 有调控作用的_区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思 考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核 细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续不连续 编码区编码区 非编码非编码四个步骤：四个步骤： 1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取1、目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子2、获取目的基因的常用方法
4、有哪些? （1）从基因文库中获取 （2）利用PCR技术扩增 （3）人工合成请阅读请阅读P9P9第一和二两段第一和二两段基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序(一)从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片 断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌 分别含有这种生物的不同基因，称为基因 文库。1.1.基因文库：基因文库：一、目的基因的获取基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因基因组文库:部分基因文库: （如:cDNA文库）含有一种生物的含有一种生物的部分部分基因基因基因组 文库与 部分基 因文库 的关系基因文库的构建模式图通过
5、通过 对受体对受体 菌的培菌的培 养而养而储储 存存基因基因 。2.基因文库的构建方法供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶与载体连接 载入受体细胞产生特定性状导入 外源DNA扩增目的基因分离(一)从基因文库中获取目的基因一、目的基因的获取基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序鸟枪法鸟枪法( (直接分离法直接分离法) )以目的基因 转录成的信使RNA 为模板，反转录 成互补的单链DNA ，然后在酶的作 用下合成双链DNA ，从而获得所需 的基因。目的基因的目的基因的mRNAmRNA单链单链DNADNA反转录酶反转录酶DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNADNA ( (目的基因目的基
6、因) )2.基因文库的构建方法(一)从基因文库中获取目的基因一、目的基因的获取基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序反转录法根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 根据已知蛋白质的根据已知蛋白质的 氨基酸序列，推测出相氨基酸序列，推测出相 应的信使应的信使RNARNA序列，然序列，然 后按照碱基互补配对原后按照碱基互补配对原 则，推测出它的结构基则，推测出它的结构基 因的核苷酸序列，再通因的核苷酸序列，再通 过化学方法，以单核苷过化学方法，以单核苷 酸为原料合成目的基因酸为原料合成目的基因 。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测
7、推测目的基因化学合成化学合成(一)从基因文库中获取目的基因一、目的基因的获取基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点缺点鸟枪法反转录法根据已知氨基 酸合成DNA法操作简便 广泛使用工作量大，盲目， 分离出来的有时并 非一个基因专一性强操作过程麻烦， mRNA很不稳定，要 求的技术条件较高专一性最强仅限于合成核苷酸 对较少的简单基因依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。如：如：1 1、根据基因的核苷酸序列、根据基因的核苷酸序列2 2、基因的功能基因在染色体上的位置、基因的功能基因在染色体上的位置3 3、基因的转录产物、基因的转录产物mR
8、NAmRNA4 4、基因翻译产物蛋白质等特性。基因翻译产物蛋白质等特性。(一)从基因文库中获取目的基因一、目的基因的获取基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序3、从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因的方法：参考“完全解读 ”P6 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_（前提条件前提条件） 、_、_ 、_._.原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循环的次数）环的次数） 结果：结果：聚合酶链式反应聚合酶链式反应 体外体外特定特定DNADNA片段片段 D
9、NADNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列 四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶 指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增( (二二) )利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 一、目的基因的获取过程：过程： a a、DNADNA变性变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_ b b、退火退火（复性复性55-6555-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引
10、物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从引物的引物的55端端33端端延伸，合成与模板互补延伸，合成与模板互补的的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链( (二二) )利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 一、目的基因的获取(二)利用PCR技术扩增目的基因基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 一、目的基因的获取 ( (三三) )人工合成目的基因人工合成目的基因根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸
11、序列合成DNADNA法法 反转录法1.1.用一定的用一定的_切割切割质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目的基因，使其产生的基因，使其产生_ _。 核心核心3.3.将切下的目的基因片段插将切下的目的基因片段插入质粒的入质粒的_ _处，再加入适量处，再加入适量_，形成了一个重组形成了一个重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 二、基因表达载体的构建质粒DNA分子限制酶处理一个切口 两个
12、黏性末端两个切口 获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种4.过程:基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 二、基因表达载体的构建 核心核心5.基因表达载体的组成：复制原点 + 目的基因 + 启动子 + 终止子 + 标记基因基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 二、基因表达载体的构建 核心核心二、基因表达载体的构建基因工程的核心目的：所需物质：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且 可以遗传给下一代，同时使目的基因能够 表达和发挥作用。它们各自 的作用是 什么?目的基因+启动子+终止子+标记基因(三)将目的基因导入受体细胞转化 方法将目的基因导入 植物细胞将目的基因
13、导入 动物细胞将目的基因导入 微生物细胞农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法显微注射法感受态细胞目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程受体细胞 稳定表达1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1）农杆菌介绍：（2）原理及适用范围(三)将目的基因导入受体细胞2、将目的基因导入动物细胞 （1）方法：显微注射法 （2）程序：(三)将目的基因导入受体细胞3、将目的基因导入微生物细胞 （1）原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少 （2）方法：目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态 细胞混合 感受态细胞吸收
14、DNA分子(四)目的基因的检测与鉴定检查是否成功检测鉴定检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法DNA分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）抗原抗体杂交DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分 子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补 的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合 在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序 列的部位，仍然是两条游离的单链。 P15思考与探究1）以下说法正确的是 （ ）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷 酸序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、基因控制的性状都能在后代表现出来D、运载体必须具备的条件之一是：具有多 个限制酶切点，以便与外源基因连接D练习练习2）有关基因工程的叙述中，错误的
