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1、 免疫组织化学技术http:/免疫组织化学技术n基本原理通过免疫学中抗原抗体结合反应，用特异性抗体（ 单克隆或多克隆）检测组织、细胞内相应的抗原物质，形 成抗原 抗体复合物；此复合物上带有事先标记的标记 物，通过与标记物相对应的检测系统，如酶底物显色反应 可使之呈现某种颜色，从而可检测组织细胞内的抗原，以 达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。n组织与细胞材料的制备n免疫组织化学方法组织与细胞材料的制备n组织石蜡切片制作n组织冰冻切片制作n细胞爬片制作n细胞涂片制作切片的制作n组织的固定n组织石蜡包埋n切片n目的:（1）防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。（2）使细胞内
2、的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。（3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造 成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。（4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制 片。 （5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。（6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。组织材料的固定n固定液的选择： (1)甲醛固定液：10福尔马林，10中性福尔马林，10中性缓冲福尔马林 (2)4多聚甲醛固定液 (3)Bouin S液及改良Bou
3、in S液 (4)Zenker S液 (5)Zamboni S液 (6)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂较适合富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。 (7)PLPD固定液 取PLP固定液25ml，加入2.5%重铬酸25ml。 (8)Kanovsky S液 (9)Methacarn固定液，对核内抗原的保存效果较好。 (10)PEG液 (11)0.4%对苯醌 (12)碳二亚酰胺-戊二醛（ECG-G）液 (13)丙酮及醇类固定剂n固定时间：固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温 度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定 液的穿透力及浓度与固定时间
4、成反比。n大组织：75乙醇30120min，85乙醇30 120min，95醇 2h，95乙醇 2h，95乙醇 过夜，无水乙醇30 60min，无水乙醇30 60min，无水乙醇60min120min，二甲苯、 和各15min（可视观察结果而定），石蜡30min 石蜡12h，石蜡23h。n小组织：75乙醇30min，85乙醇30min，95 乙醇1h、1h、过夜或2h，无水乙醇、 和各30min，二甲苯15min、10min、10min （肉眼观察），石蜡30min，石蜡30min，石蜡 12h。组织石蜡包埋切 片n载玻片的清洁：市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干 涂胶
5、，如需开展原位杂交，还需将玻片240烤2h。n切片粘合剂的使用： （1）多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。 （2）APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）干净载玻片丙酮5min 用镊子夹住浸入APES试剂（1ml+50ml 丙酮） 13次纯丙酮洗二次干燥玻片用铝箔包好，室温 或4保存备用。（3）铬矾明胶液：铬矾0.5g 明胶5g H2O2 1000ml（4）甲醛明胶液：40甲醛2.5ml 明胶0.5g H2O2 100mln切片：石蜡切片： (1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。(2)5260烤片18h。(3)切片厚24m。(4)切片刀要快(5)编上号(6)切片可在4保存数年冰冻切
6、片：(1)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理24h，冰冻切片。(2)冰冻切片后需凉干后立即固定(3)冰冻切片固定后-80保存备用细胞爬片制作n将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养 瓶或六孔板内。n待细胞生长达到60以上后取出玻片。n用4%的多聚甲醛固定2h以上。n可加甘油封存置于零下20度保存。细胞涂片制作n离心将细胞收集出来，用预冷的PBS洗 23遍，最后用PBS将细胞重悬。n吸取3050ul（可根据细胞量调整）滴 至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。n待稍微风干以后加4多聚甲醛溶液覆 盖细胞，固定24小时。n在细胞上加一层甘油放-20保存。免疫组织化学方法荧光标记免疫组织化学酶联
7、免疫组织化学荧光标记免疫组织化学直接法 间接法酶联免疫组织化学 ABC法 S - P法免疫组化二步法 二步法免疫组化染色步骤n二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯nPBS冲洗3次，每次3分钟n根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复 n0.3%过氧化氢甲醇液阻断20分钟，以消除内源性过氧 化物酶的活性nPBS冲洗、浸泡5分钟，3次n正常山羊血清室温封闭10分钟n甩去血清，加入适当稀释的一抗，37孵育60分钟或 4过夜nPBS冲洗，浸泡5分钟，3次n滴加多聚螯合物，37孵育30分钟nPBS冲洗，浸泡5分钟，3次n新鲜配置酶底物显色液DAB显色310分钟n流水冲洗n苏木素复染，脱水，透明，封片。n
8、显微镜观察拍照nIPP软件分析光密度抗原修复方法n真空负压抗原修复法： 切片脱蜡至水。 0.3%H2O2甲醇真空负压处理5分钟。 自来水洗，蒸馏水洗。 0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），真空负压 干燥箱预先调至95，真空负压处理10分钟。 待修复注降至室温的一，PBS洗3次，随后按 选好的免疫组化染色方法进行染色。n微波辐射抗原修复法： 切片脱蜡至水。 0.3%H2O2甲醇处理10分钟。 自来水洗，蒸馏水洗。 0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），于微波炉内 微波辐射10分钟，如检测Er和Pr则需要20辐射分 钟左右。 待修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选好 的免疫组织化学的染色
9、方法进行染色。n高压抗原修复法： 切片脱蜡至水。 0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。 自来水洗，蒸馏水洗。 切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅 中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续14分 钟。 待修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选 好的免疫组织化学染色方法进行染色。n隔水热抗原修复法： 切片脱蜡至水。 0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。 自来水洗，蒸馏水洗。 切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH0.6）中， 边同容器一起放入水溶锅中加热，其间应不断用 温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效 温度后（92）。即开始计时，持续40分钟。 待抗原修复液恢复至室温后，PBS
10、洗3次，随后 按选定好的免疫组化染色方法进行染色。n电炉加热抗原修复法： 切片脱蜡至水。 0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。 自来水洗，蒸馏水洗。 将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时 用温度计测量温度，当达92后，即可拔离电源 ，当温度低于92时，再插上电源，如此反复持 续至10分钟左右。 待抗原修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按 选定的免疫组化染色方法进行染色。n胃蛋白酶消化法： 切片脱蜡至水。 0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。 自来水洗，蒸馏水洗。 PBS洗3次，1分钟/次。 滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，处理切片20 分钟左右。 PBS冲洗3次，2分钟/次。 后按选择
11、好的免疫组化该法进行染色。n胰蛋白酶消化法： 切片脱蜡至水。 0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。 自来水洗，蒸馏水洗。 PBS洗3次，1分钟/次。 滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片20 分钟左右。 PBS洗3次，2分钟/次。 后按选好的免疫组化染色方法进行染色。注意事项一、抗体的保存浓缩抗体：有效期内，只需放在4 冰箱内，保存时间可达1-3年。即用型抗体：理论上在4 冰箱内 可保存半年左右。PBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般 只可放置1-2个月。二、出现假阳性的原因组织切片质量不佳，造成假象，如 刀痕裂缝边缘的组织着色过深，不能作为判断阳性的依据。出血和坏死：红细胞的内源性过氧 化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化物酶均可出现假阳性反应。抗体的交叉反应。三、出现假阴性的原因固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失 ，无法补救。固定液不合适或浓度不对，导致固定不佳。最好使用 10%中性福尔马林。抗体浓度过低。孵育时间太短，或孵育温度太低。缓冲液pH值不正确。四、必须严格设置阳性对照和阴性对照。五、DAB有致癌性，用后不应随处倒弃。http:/
