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1、酶联免疫吸附试验检测法的 质量控制 酶联免疫吸附试验（ELISA）：几乎所有的可溶性 抗原-抗体系统均可用以检测，它的最小可测值达 ng甚至pg水平，达到10-810-12g 。其基本方法是 将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微 量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相 表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常 用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于 检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。 因其方法学相对简便，灵敏度高，特异性好，经济 安全等特点而在临床上广泛应用，但是由于其操作 步骤复杂，一般包括试剂准备，样本收集，加样， 温育，洗涤，显色，比色，结果判
2、定等，其中任何 一项操作不当都会对检测结果产生很大影响。因此 ，必须加强ELISA检测的全面质量控制，保证其结 果的准确可靠。 影响抗原抗体反应的原因 一、反应物自身因素 不同来源的抗体，反应性各有差异，抗体的浓度 、特异性和亲和力都影响抗原抗体反应，为提高 试验的可靠性，应选择高特异性、高亲和力的抗 体作为诊断试剂。等价带的宽窄也影响抗原抗体 复合物的形成，单克隆抗体不适用于沉淀反应。 抗原的理化性状、分子量、抗原决定簇的种类及 数目均可影响反应结果。颗粒性抗原出现凝集反 应，可溶性抗原出现沉淀反应，单价抗原与相应 抗体结合不出现沉淀现象。 影响抗原抗体反应的原因 二、环境条件 (一)电解质
3、 抗原与抗体发生结合后，由亲水胶体变为疏水胶 体的过程中须有电解 质参与才能进一步使抗原抗 体复合物表面失去电荷，水化层破坏，复合物 相 互靠拢聚集形成大块的凝集或沉淀。若无电解质 参加，则不出现可见 反应。为了促使沉淀物或凝 集物的形成，常用 0.85%氯化钠或各种缓冲液作 抗原及抗体的稀释液及反应液。但电解质的浓度 不宜过高，否则会出现盐析现象。 影响抗原抗体反应的原因 (二)酸碱度 蛋白质具有两性电离性质，因此每种蛋白质都有固定的等 电点。抗原抗体反应必须在合适的pH环境中进行，pH 过 高或过低都将影响抗原与抗体的理化性质抗原抗体反应一 般在pH 为 69 进行。 (三)温度 抗原抗体
4、反应必须在合适的温度中进行，一般以 15 40为宜，最适宜反应温度为 37。某些特殊的抗原抗 体反应，对温度有一些特殊的要求，例如冷凝集素在 4 左右与红细胞结合最好，20以上反而解离。 此外，适当振荡和搅拌也能促进抗原抗体分子的接触，加 速反应，其作用与反应物粒子大小成正比。PBS 磷酸盐缓冲液 一般的有活性的生物制剂都要用它来稀释,原因就 是它具有盐平衡、可调整的适宜pH缓冲作用,蒸馏 水不具有盐平衡作用,可以破坏生物蛋白的结构及 生物特性；生理盐水不具有调整pH的作用,对完整 的、具有活性的物质不能保证其在最适条件下参 与生物反应,所以使用PBS是首选. PBS也不是万能的,有的生物活性
5、物质需要的条件 比PBS还要高,就需要在平衡缓冲液中加入更多的 成分,维持最佳的条件保证生物活性物质保持其最 完整的特性. 1 试剂 优质的试剂是保证检验质量的基础。近年来，国家采用批 检的形式对ELISA试剂严格把关，但不同厂家的试剂在使用 效果上仍存在差异，试剂质量在很大程度上决定了检测水平 ，因此在使用之前必须对试剂进行严格评估。选择质量好的 试剂，在了解某种试剂的组成基础上选择多家试剂盒进行比 较，应选择灵敏度高，特异性好，精密度（CV）好（批内 CV 值小于15 %），稳定性和安全性好，且简便经济的试剂 。从4冰箱取出的试剂必须放置室温2030 min 后再启 用，否则水化层的形成可
6、能影响试剂的原始浓度及试剂中溶 质分子的均匀分布。未用完的试剂和质控品应密封并及时放 回冰箱保存。根据蛋白质在冷冻过程中出现蛋白分子分布改 变的特点，试剂正式启用前应充分混匀。所用蒸馏水、去离 子水和自行配制的缓冲液等，都必须调整其pH 值和离子强 度等。不同批次的试剂在制作过程中很难保证质量完全一致 ，因此必须选择和订购长批号的试剂，并保证保存条件，严 格执行这一标准可以避免试剂批号改变而重建质控体系及重 新评估试剂的复杂过程，并且能够保证结果的稳定性。 2 标本 患者标本中有可能含有干扰试验的免疫物质，导致假阳性或假 阴性的结果，干扰因素一般可分为两类，即内源性和外源性干 扰因素。内源性干
7、扰因素一般包括类风湿因子、补体、高浓度 的非特异性免疫球蛋白、异嗜性抗体及某些自身抗体等，避免 内源性干扰因素主要通过选择合适的试剂；外源性干扰因素包 括标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存时间过长及标本凝固 等， ELISA 的灵敏度1ng/ml,避免污染，与生化分杯。标本 在低温下保存时间过长，IgG可聚合成多聚体，在间接法ELISA 测定中会导致本底加深，甚至出现假阳性结果。通常血清标本 可在28保存5天，冷冻保存时间会更长。血清标本应充分 离心，否则可因纤维蛋白原非特异吸附于微孔而造成假阳性结 果。冷冻保存标本避免反复冻融，标本的反复冻融会因其所产 生的机械剪切力对标本中的蛋白等分子产生
8、破坏作用，使抗体 效价下降从而引起假阴性结果。标本的采集及分离要注意尽量 避免细菌的污染。此外，标本在冻存时会因蛋白质局部浓缩分 布不均，因此重新溶解的标本必须混匀，但不要剧烈振荡和反 复颠倒。3 操作因素 3.1 加样 加样器是一种比较精密的工具，其在长时间使用时会因 机械磨损或推动杆内附着的血痂等原因造成加样不准，因 此必须定期对加液器进行维护和校准。每次加不同的标本 均需更换吸嘴，以免发生交叉污染；加样速度不可太快， 以免将标本加在孔壁上部，并注意不要溅出或产生气泡， 加样时还应注意操作时差对结果的影响，尤其对竞争法检 测结果影响更大。因此建议在加酶结合物和底物时用多道 加液器，或者双人
9、同时加样以减少操作时差对结果的影响 ，另外有些项目在检测前需要稀释以减少非特异性反应。 稀释的方式非常重要，最佳方式是采用振荡器混匀，不可 随意改变混匀方式。 3.2 温育 3.2.1温育的温度：育常采用的温度有43 、37、室温或4等。37是实验室中常 用的温育温度，也是大多数抗原抗体结合 的最适反应温度。抗原抗体反应一般在 37经12 h 产物的生成可达顶峰，为加 速反应，可在一定范围内提高反应的温度 并在反应过程中连续振荡来增加抗原抗体 接触的概率。抗原抗体反应在4更为彻底 ，形成的产物更多、更稳定，但因所需时 间太长，在ELISA检测中一般不予采用。3.2 温育 3.2.2温育的方式：
10、温育方式常采用温箱法、微波 辐射法和水浴法。其中水浴法能较好解决因受热 不均衡所致的周围孔与中央孔结果的吸光度差异 （即“边缘效应”）。可将ELISA板置于水浴箱中 ，板底应贴着水面，使温度迅速平衡，为避免蒸 发，可用塑料贴封纸覆盖板孔。若用温箱，ELISA 板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料 （如金属等），在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA 板放在湿纱布上。温育过程中每块反应板不能重 叠放置，防止温度扩散的不均匀性。3.3 洗涤 洗涤是ELISA不同于均相免疫学检测技术的一大特征，洗涤 在整个ELISA反应过程中虽不是一个反应步骤，却非常关键。其 目的是去除反应体系中与反应无关的成分
11、，包括未结合的酶结 合物以及反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。洗 涤液通常为含有一定浓度Tween 20 的缓冲液，Tween 20 是一 种非离子去垢剂，既含亲水基团，又含疏水基团，在洗涤中的 作用机制是借助其疏水基团与经疏水性相互作用被动吸附于聚 苯乙烯固相上蛋白分子的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白 分子与固相的吸附。同时在其亲水基团与液相中水分子的结合 作用下，促进蛋白质分子脱离固相而进入液相，最终被洗脱， 。必须注意非离子去垢剂的使用浓度，最常用的洗涤液是含 0.05 %Tween20，pH为中性的磷酸盐缓冲液，如果洗涤液中 的Tween20 超过0.2% ，可使包被于固相
12、上的抗原抗体解吸附 而影响实验的测定下限。洗涤可采用洗板机或手工洗涤两种方 式，手工洗板则分为浸泡式和流水冲洗式洗涤。无论洗板方式 如何，在向板内注液时应当避免气泡残留孔内，否则会因洗涤 液难以进入孔中而影响洗涤效果。在采用洗板机洗板时，要保 证洗板机上的每个吸液针都能一致地插入板孔底部将洗液完全 吸净，要求洗板后残液小于2 L ，即人工扣板垫纸不湿，浸泡 时间超过45 s。3.4 显色 大多数情况下ELISA商品多选用HRP 和碱性磷酸酶（ALP ）。HRP可催化的底物为过氧化氢，参加反应的显色供氢 体有邻苯二胺（OPD）、邻联甲苯胺（OT）及四甲基联苯 胺（TMB）等。其中OPD 难溶于水
13、，见光易变质，使用前 配制，反应过程须避光且OPD有一定毒性。TMB 的反应产 物为蓝色，目视对比鲜明，其性质稳定，对人体无毒。若选 用各类酸性终止液，则会使蓝色转变为黄色。TMB作底物 时的产物检测波长为450 nm ，ALP 作为标记物，其底物 一般采用对硝基苯磷酸酯（pNPP），产物为黄色的对硝基 酚，吸收波长是405 nm。为了保证结果的稳定性，必须要 严格按照试剂盒说明书中规定的温度和时间操作，不可随意 改变温度和时间。3.5 比色 ELISA 显色结果必须通过酶标仪进行检测，不可由肉眼判 断结果，因为不同个体的色觉存在差异，尤其是对于乙型肝炎 病毒e抗体、乙型肝炎病毒核心抗体这样的
14、检测项目，肉眼难 以判断。酶标仪应采用双波长进行测定，包括对颜色产物敏感 和不敏感的2个吸收峰波长，用非敏感波长清除由于容器上的 划痕、指印、背景等造成的干扰。TMB最大吸收波长为450 nm ，非敏感波长为630 nm ，一般不设空白孔，否则会出现 吸光度值为负值的现象。加入终止液后应尽快比色，否则样本 吸光度值会逐渐下降，显色越深下降越快，应在2-30 min 内 比色。 严格按照说明书操作3.6 应加强检测仪器的质量控制 如定量移液器要定期校准；洗板机要及时倾倒 废液罐，补充洗涤液，开机后运行冲洗程序（双 蒸水），检查系统液路系统（有无漏水），检查 吸液和注液速度，关机运行冲洗程序（双蒸
15、水） ，清洗吸针及水箱，仪器外观清洁；酶标仪要定 期检查滤光片是否合格，光源是否稳定，机械系 统是否有故障，保持外观清洁，并定期请厂家工 程师进行保养维修；水浴箱及存放试剂的冰箱要 每天监测温度，并有记录等。4 结果的判定与报告 4.1 结果的判定 严格依据试剂盒提供的阳性判定值（C.O）进行 结果判定。厂商提供试剂的同时，说明书上列出 的C.O值是建立在一系列科学试验及统计研究的 基础上，不应随意更改，注意说明书版本更新、 换厂家。 定量测定需要制备标准曲线，根据标准曲线计算 结果。 定性试剂禁止用于定量检测4 结果的判定与报告4.2 灰区的设置 通常情况下ELISA结果报告方式为“阴性”或
16、“阳性”， 在二者之间有一条明确的分界线，也就是所谓的阳性判定值 即C.O值，对于样本的吸光度值（A）高于C.O值就判断为阳 性，相反则判断为阴性，然而在实际工作中经常会出现样本 A 值位于C.O 值附近的人群，即ELISA 检测的“灰区”。在 国内的传染性病原体抗原和抗体检测的ELISA试剂盒中均未 涉及到“灰区”的设置，仅仅依靠C.O值来决定感染的有无 ，尤其是对医闹群体的筛查具有较大风险。我们在实际工作 中发现，结果处于C.O值附近的患者重复性很差，也是容易 引起医疗纠纷的人群。因此对于检测结果位于“灰区”的患 者可采用确认试验或追踪检测方法加以确诊。 “灰区”是现实事物对人类主观认识的回应4.3 标本的复查 ELISA 手工操作过程复杂，影响因素较多，即 使室内质控在控，也可能因孔间差异而造成结果
