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1、molecular fluorescence analysis 1荧光的发现Lignum Nephriticum的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱天蓝色荧光；2荧光的发现34光致发光荧光磷光物质分子吸收光能后，其电子由基态 跃迁到激发态，激发态的分子以电磁 辐射的形式释放能量回到基态，称为 光致发光受光激发的分子从第一激发单重态 的最低振动能级回到基态所发出的 辐射。受光激发的分子从第一激发三重态 的最低振动能级回到基态所发出的 辐射。5分类(1)射线荧光、紫外可见荧光和红外荧光(激发光的波长不同)(2)分子荧光和原子荧光(发射荧光的粒子不同)6特点：（1）灵敏度高比紫外-可见分光光度法高2
2、4个数量级；检测下限：0.10.1g/cm-3相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。（2）选择性强既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3）直接发荧光化合物少缺点：应用范围小。7第一节 基本原理一、分子荧光产生过程二、激发光谱与荧光光谱三、荧光物质的分子结构四、荧光强度与溶液浓度的关系五、影响荧光强度的外部因素8一、荧光的产生过程1. 分子能级与跃迁分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级。多数分子常温时处在基态能级，当吸收能量便可发生能级间跃迁。为便于说明电子跃迁过程，必须确定电子能级类型（多重性），M=2S+1，S轨道总自旋量子数。 S取值为
3、0或1。S=0时M=1，此时电子所处的能级为单重态用符号S表示。S=1时M=3，此时电子所处的能级为三重态用符号T表示。9处于分离电子轨道的非成对电子，平行自旋比配对自旋更稳定，因此，三重激发态的能级比相应的单重激发态的能级低。 2. 单重态与三重态T1S1S0103.激发态基态的能量传递途径传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛豫无辐射跃迁11S2S1S0T1absorptionfluorescencephsophorescenceintersystem crossinginternal conversionvibrational relaxationenergyl 2l
4、 1l 3external conversionl 2T2internal conversionvibrational relaxation12（1）振动弛豫（Vibrational Relaxation, VR）在液相或压力足够高气相中，处于激发态分子通过与溶剂分子碰撞而将部分能量以热的形式传递给周围溶剂分子，电子则从高振动能层返回到低振动能级过程，称为振动弛豫。该过程在同一电子能级内进行。（2）内转换（Internal Conversion，IC）对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级低振动能层与较低电子能级高振动能层相重叠时，电子可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁过程，如S2
5、-S1；T2-T1。该过程在同一类电子能级相邻的激发态间进行。13（3）外转换（External Conversion，EC）受激分子与溶剂分子或其它分子相互碰撞而失去能量，从而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭”或“猝灭”。该过程发生在S1S0，T1S0（4）系间跨跃（Intersystem Conversion，ISC）系间跨跃是发生在两个不同多重态之间无辐射跃迁，如从S1到T1，该跃迁是禁阻的。然而，当不同多重态的两个电子能层有较大重叠时，处于这两个能层上受激电子自旋方向发生变化，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射跃迁，该过程称为系间跨跃。发生在不同多重态之间14（5）荧光发
6、射电子从第一激发单重态最低振动能级（时间10-9-10-7s）以辐射形式跃迁到基态各振动能级所产生的光子辐射称为荧光或荧光发射。由于各种去活化过程的存在，荧光辐射能通常要比激发光能量低，即荧光波长总是大于激发波长。（6）磷光发射电子从第一激发三重态的最低振动能级以辐射形式跃迁到基态的各个振动能级所产生的光子辐射称为磷光或磷光发射。由于三重态振动能级比单重态的低，即磷光波长总是大于荧光波长。15(一)激发光谱：固定发射波长扫描激发波长所得到的曲线固定发射波长扫描激发波长所得到的曲线 固定固定 emem=620nm(MAX)=620nm(MAX) exex =290nm =290nm (MAX)(
7、MAX)二、激发光谱和荧光光谱excitation spectrum and fluore-scence spectrum162. 2. 三维荧光光谱三维荧光光谱I I F Ff f ( ( exex 、 emem) )蒽的激发光谱蒽的激发光谱固定发射波长、扫描激发波长固定发射波长、扫描激发波长17固定固定 exex=290nm =290nm (MAX)(MAX) emem= = 640nm640nm(MAX)(MAX)（二）发射光谱(荧光光谱)：固定激发波长扫描发射波长固定激发波长扫描发射波长所得到的曲线所得到的曲线 分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即使分子被激发
8、到高于S1的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降到S1电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。18I I F Ff f ( ( exex 、 emem) )蒽的发射光谱蒽的发射光谱固定激发波长、扫描发射波长固定激发波长、扫描发射波长19（三）荧光光谱的特征 （1）荧光光谱的形状与激发波长无关(荧光光谱的强度与激发波长有关)（2）荧光光谱比激发光谱波长长 （3）镜像对称 20 exex =290nm =290nm (MAX)(MAX) emem= = 640nm640nm(MAX)(MAX)S S0 04 43 32 21 1S S1 14 4 3 3 2 2 1 11
9、1 4 41 1 3 31 1 2 21 11 11 1 4 41 1 3 31 1 2 21 1 1 121与与发射光谱相同条件下的磷光光谱发射光谱相同条件下的磷光光谱激发光谱激发光谱发射光谱发射光谱22三、荧光强度与分子结构的关系（一）分子产生荧光必须具备的条件：（1）具有强的紫外-可见吸收的特征结构(共轭大键) （2）具有较高的荧光量子产率(,衡量物质分子受到激发后发射荧光的能力,)荧光量子产率的高低取决于荧光辐射跃迁于无辐射跃迁之间的竞争,而竞争的优劣在很大程度上与分子自身结构有关.23kF(速率常数)主要取决于荧光物质的分子结构； ki主要取决化学环境，同时也与荧光物质的分子结构有关
10、。大多数的荧光物质的量子产率在0.11之间；例如：0.05mol/L的硫酸喹啉，F=0.55；荧光素 F=1化合物化合物 F F0.110.110.290.290.460.460.600.600.520.52241. 1. 跃迁的类型跃迁的类型(二) 荧光强度与分子结构关系对于有机荧光物质: * * n n * * maxmax 100 100 平均寿命平均寿命1010-5-51010-7-7s s * * maxmax10104 4 平均寿命平均寿命1010-7-71010-9-9s s k kS S T T小小 * * n n * 是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。强荧光的有机化合物具备
11、下特征:具有大的共轭键结构(激发程度强)；具有刚性的平面结构(分子稳定,能量不易丢失)；具有最低的单重电子激发态S1,为 * 型跃迁(能量差小)；取代基团为给电子取代基(增加电子离域,*能量变小)。252. 2. 共轭效应共轭效应产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越 大，离域大键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易产生。化合物化合物苯苯萘萘蒽蒽丁丁 省省戊戊 省省 exexmaxmax(nm(nm) )205205286286365365390390580580 ememmaxmax(nm)(nm)278278321321400400480480640640 F F0.110.11
12、0.290.290.460.460.600.600.520.52荧光物质的刚性和平面性增加，分子振动减弱,能量不易丢失有利于荧光发射。3. 3. 刚性平面结构刚性平面结构 芴芴联苯联苯 F F=1=1 F F=0.2=0.226不产生荧光不产生荧光产生荧光产生荧光产生荧光产生荧光不产生荧光不产生荧光 F F=0.92=0.92萘萘V VA A F F( (萘萘) )= = 5 5 F F( (V VA A) )荧光黄荧光黄酚酞酚酞偶氮菲偶氮菲偶氮苯偶氮苯27284. 4. 取代基效应取代基效应 1 1）给电子取代剂加强荧光）给电子取代剂加强荧光( (含有含有n n电子，与电子，与轨道平行轨道平
13、行) ) HNHN2 2， NHR NHR ， NR NR2 2， OH OH， OR OR ， CN CN产生 p 共轭，扩大共轭体系，使波长变大，提高二苯甲酮：弱荧光、强磷光S1 T1的系间窜跃产率接近1化合物化合物苯苯苯酚苯酚苯胺苯胺苯基氰苯基氰苯甲醚苯甲醚 emmax (nm)278310285365310405280390285345相对荧光强度10182020202 2）吸电子取代基减弱荧光、加强磷光）吸电子取代基减弱荧光、加强磷光 C=0C=0， COOH COOH ， NO NO2 2不产生 p 共轭， S1 T1系间跨越强烈硝基苯：不产生荧光、弱磷光S1 T1的系间窜跃产率接
14、近0.6029空间位阻对荧光发射的影响3 3）取代基的位置）取代基的位置反式二苯乙烯反式二苯乙烯 强荧光物质强荧光物质 F F= =0.750.75 F F= =0.030.03立体异构体对荧光发射的影响立体异构体对荧光发射的影响顺式二苯乙烯顺式二苯乙烯 非荧光物质非荧光物质电离效应对荧光发射的影响电离效应对荧光发射的影响OHOH- -H H+ +pH=1, pH=1, 有荧光有荧光pH=13, pH=13, 无荧光无荧光pH13无荧光 位阻 小30根据Lambert-Beer定律：所以溶液吸收的光强度 Ia四、荧光强度与溶液浓度的关系由于溶液的荧光强度 IF 与溶液对光的吸收程度及荧光效率成
15、正比，即：IFIa31当abc0.05（即溶液很稀）时，方框里的可忽略对于一定的荧光物质，当测定条件固定时，IFIFIFk32五、影响荧光强度的外部因素1.温度的影响2.溶剂的影响3.溶液pH的影响4.散射光5.溶液荧光的猝灭331、温度：对荧光强度有显著影响。随温度升高荧光强度降低。因此体系降低温度可增加荧光分析灵敏度2、溶剂：溶剂极性可增加或降低荧光强度（改变*及n* 跃迁的能量）；溶剂黏度愈小，溶剂分子与荧光分子碰撞增加，能量丢失明显荧光强度减弱；溶剂不纯则会干扰荧光物质荧光强度和光谱形状。荧光分析中对溶剂水需要重蒸馏才能使用。3、酸度（1）影响荧光物质存在形式，当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，在不同pH值其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生34改变。pH13 无荧光 （2）影响配合物的组成 金属离子与有机试剂生成荧光配合物 ，溶液pH的改变会影响配合物的组成和
