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1、第五章 分子荧光光谱分析第一节 荧光光谱法的基本原理日常生活中的荧光现象:印染厂的废水在阳光下发 光、公路上的各种标志等。分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy )又称为荧光光谱法或荧光分析法 是以物质所发射的荧光强度与浓度之间的线性 关系为依据进行的定量分析，以荧光光谱的形状 和荧光峰对应的波长进行行的定性分析光致发光（Photoluminescence）: 荧光和磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时的发光现象. 荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最 低振动能级回到基态所发出的辐射。 磷光：从第一激发三重态的最低振动能级回到 基态所发
2、出的辐射。分子的多重态单重态 一个所有电子自旋都配对的分子的电子 状态。大多数有机物分子的基态是单重态。 当基态一对电子中的一个被激发到较高能 级，其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于 单重态。三重态 有两个电子的自旋不配对而平行的状态。 激发三重态能量较激发单重态低。一、分子退激发的过程激发态分子回基态的途径很多，速度最快的途径占 优势。1、振动驰豫 1）分子吸收光子后，可能被激发到激发态的各个 振动能级 2）通过碰撞（非辐射跃迁）到达同一激发态的最 低振动能级 需时间10-1310-11sec，效率较高2、荧光发射 分子从单重激发态的最低振动能级发射光子回 到基态荧光发射。 荧光光谱的波长比
3、吸收光的波长大（长），这 种现象叫作红移或斯托克斯位移。3、内部转换 1）分子内过程，热退激 2）两个激发态重叠的能级发生内转换，因此吸 收1、 2 两种波长的光后，都产生 2 的荧光。4、外转换 激发态分子与溶剂或其它溶质间相互作用和能量转换。5、能系间交叉跃迁 电子自旋被反转，使分子的多重性发生变化6、磷光从三重态最低振动能级回到基态，放出磷光。二、影响荧光强度的因素1、荧光效率（荧光量子产率）物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（）表 示：吸收的光子数发射的光子数 激发态的分子数发射荧光的分子数=Fff与退激发过程的速率常数k有关iceciff kkkkk +=Ff凡是使荧光速率常数kf
4、增大而使其他退激发过程 （能系间交叉、外转换、内转换的速率常数减小的 因素都可使荧光增强。Kf、Ki与分子结构有关，Kec、Kic与分子所处的环 境有关高荧光分子f 1，无荧光分子f 02、影响荧光强度的因素 1）荧光与分子结构的关系 a、能吸收紫外可见光，有共轭双键，分子呈刚 性、平面、多环结构，而且共轭平面越大、电子共轭度越大， f越高。 b、取代基的影响 给电子基团使f增强，如-NH2、-OH 与电子体系相互作用小的取代基对荧光影响小 高原子序数的原子引入电子体系，使荧光减弱 吸电子基团，如：-COOH 、NO2 、N=O2、 卤 素使荧光熄灭。 刚性平面结构有利于荧光，因为刚性结构可以
5、减 少分子振动，减少能系交叉和碰撞退激。 2）温度和溶剂效应 温度升高， f下降 溶液黏度下降， f下降 不能使用含有重原子的溶剂溶剂极性增加有时会使荧光强度增加，荧 光波长红移；若溶剂和荧光物质形成氢键或 使荧光物质电离状态改变，会使荧光强度、 荧光波长改变。 3）pH值的影响 荧光物质的电离与非电离形式的f有差别，带有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与pH关； 4）溶解氧的影响 溶解氧的存在使f下降第二节 荧光分光光度计一、基本构造 1、光源 强度较高的氙灯或氙汞灯，要求有稳定的供电源。 2、单色器 两个，互成直角 3、样品池 四通杯 4、检测器 光电倍增管二、仪器光路光源激发单色器样品
6、池发射单色器检测器第三节 荧光光谱法的基本参数及测量一、荧光强度根据朗伯-比尔定律Ia=I0-I=I0(1-10-bc)则If=fI0（1-10-kbc)=I0(1-e-2.303k=bc) 对于稀溶液，kbc=A A0.05If= 2.303 f I0 kbc当I0一定并且浓度C很小时,荧光强度与荧光物质浓度成正比If= KC K = 2.303 I0 kb)Cmax0.05/kb当C超过Cmax 时，IfC偏离线性溶液浓度太大，荧光分子之间及荧光分子与溶剂分 子之间碰撞，发生非辐射跃迁，使荧光强度下降。荧光自熄灭：C增大到一定程度，就会发生荧光自熄灭现象荧光自吸收：荧光荧光波长与激发光波长
7、重叠时，荧光被吸收二、激发光谱与发射光谱激发光谱:固定发射波长(EM),一般在最大发射位置 做If EX的光谱，既不同波长激发光所 产生荧光的相对效率。发射光谱:固定激发波长(Ex),一般在最大吸收位置 做If EM的光谱，既最大吸收波长下产 生荧光的相对强度。目的:找到EXmax 和EMmax三、荧光分析法直接荧光法：样品本身发荧光，直接测定其荧光强 度，按吸收定律计算样品浓度。间接荧光法：样品本身不发荧光，通过探测剂（强 荧光物质）间接测定。 探测剂称为荧光探针样品浓度的定量计算采用标准曲线法四、荧光分析法的应用无机物分析 无机离子中除少数例外一般不发荧光.但很多无机离子能与一些有机试剂形成荧光络合物,而进行定量测定.生物化学及生理医学方面的应用 荧光法对于生物中许多重要的化合物具有很多的灵敏度和较好的物效性,故广用于生物化学分析,生理医学和临床分析.药物分析荧光分光光度计作为高效液相色谱,薄层色谱和高效毛细管电泳等的检测器,使有效的分离手段与高灵敏度,高选择性的测定方法结合起来,可用于测定复杂的混合物荧光团杂化纳米二氧化硅微球
