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1、工具酶第四章 工具酶工具酶基因工程技术中能用于DNA和RNA 的合成、连接、切割和修饰的各种酶。包括：限制酶,核酸酶.聚合酶, 连接酶, 激酶, 磷酸酶, 第一节 限制性内切酶（Restriction Endonuclease） 一. 细菌的限制一修饰现象被发现 瑞士塞尔生物研究中心Arber提出限制一修饰理论：核酸内切酶降解细菌外源DNA,修饰酶保护自身DNA Arber首次从 E.Coli B菌株中分离出型限制酶EcoB 美Hopkings大学 H.Smith从流感嗜血菌中分离 型 限制酶 Arber, Smith获得1978 年Nobel奖二.限制酶系统分类和命名1985年后大量限制酶被
2、发现，已从350多种微生物中发现2000多种限制酶，识别108种不同的特定序列 限制性内切酶的分类 型: 特异识别、随机切割型：特异识别、同点切割型：特异识别、异地切割通常所指的限制酶即类酶限制酶特性比较 I型 II型 III型 限制与修饰由 同一酶承担 是 否 是 酶反应辅助因子ATP.mg+ SAM mg+ ATP.mg+SAM 识别位点特性 / 4-6bp回文对称/ 切割位点 距离1kb 识别点中 距3端24-26bp 举例 EcoB BamHI EcoPL 识别位点TGAN8TGCT G GATTC AGACC 克隆工作中用途 无 有 无SAM: 硫一腺苷甲硫氨酸三.系统命名法限制性内
3、切酶的命名方法属名 种 变种 序数1字母 2字母 1字母(EcoRI) E co R I(HindIII)H in d III(BamHI) B am H I四.一般限制酶的识别特点1. 大多数是严格的识别顺序，少数可变2. 识别顺序的碱基数一般为4-6 bp，少数识别更长3. 多数识别位点具有旋转对称性，少数的识别位点在切割位点之外，具旋转对称性4bp HpaC CGGHae GG CC5bp Ava G GWCCEcoR CCWGG6bp BamH G GATTCSmaCCC GGG11bp Bg1 GCCNNNN NGGC 12bp BstXCCANNNNN NTGCN=A, T, G,
4、 C五. 限制酶的切割末端5粘端 （EcoR I）3粘端 （Pst I）平端 （Sma I） 六.限制酶产生的末端的连接1. 匹配粘端: 直接连接2. 平末端: 万能连接3. 不匹配粘端： S1 Nuclease切去突出端或Klenow补平七.识别位点与切割方式之间的关系1.识别不同，切割不同 eg: BamHI EcoRI-G GATC C- - A GATCT- -C CTAG G- - T CTAG A-2.识别不同，切割产生末端相同(同尾酶)eg: BamHI Bg1 - A GATCT -G GATCC- T CTAG A -CCTAG G3.识别相同，切割不同eg: SmaI Xm
5、aI-CCC GGG-C CCGG -GGG CCC- -G GGCC C-4识别相同，切割相同同工酶 同裂酶 eg: Hpa Msp -CCGG- -C * C GG-GG CC- -G G CC-八.限制酶反应的影响因素1. 温度：一般37C，有例外,如：SmaI 25C，BclI 50C，TaqI 65C2. 缓冲液：高、中、低盐之分 (NaCl)3. 时间：1-1.5小时4. 反应体积和甘油浓度：酶8.0)存在有害试剂(1%乙 醇, DMSO, 乙二醇)阳离子变化:Mn+, Co+, Zn+, Cu+代替mg+酶的灭活1.加热 2.酚抽提第二节 修饰酶一.分类细菌DNA聚合酶 *E.
6、Coli DNA聚合酶（全酶）*Klenow酶T4噬菌体DNA聚合酶 T4噬菌体DNA聚合酶*测序酶（修饰的T7 pol） *Taq DNA聚合酶 *反转录酶 末端脱氧核苷酸转移酶依赖于DNA的RNA聚合酶SP6噬菌体RNA聚合酶 T3噬菌体RNA聚合酶T4噬菌体RNA聚合酶连接酶E. Coli DNA连接 *T4 DNA连接酶T4噬菌体 RNA连接酶 激酶 T4噬菌体多核苷酸激酶 磷酸酶*碱性磷酸酶 核酸酶Ba131核酸酶 S1核酸酶 绿豆核酸酶RNaseA RNaseT1 DNaseI EXo 噬菌体外切核酸酶二.聚合酶1. E. Coli DNA聚合酶 活性:（1）53DNA聚合酶活性（
7、2）35核酸外切酶活性（3）53核酸外切酶活性主要用途：切口平移法标记DNA2. Klenow酶 枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解E. Coli DNA聚合酶得到的该酶的大片段活性：（1）53聚合酶活性（2）35外切核酸酶活性主要用途：(1)补平3凹端(2)补平3凹端，末端标记(3)合成cDNA第二链(4)体外诱变中从模板合成DNA第二链3. T4 噬菌体DNA聚合酶活性：（1）53聚合酶活性（2）35外切核酸酶活性, 比 Klenow酶强200倍用途: 3突出端切平 4. T7噬菌体DNA聚合酶 活性： 53聚合酶活性很强, 无35外切核酸酶活性主要用途：修饰后用于测序 5. Taq酶耐热(75
8、-80 C)的DNA聚合酶专用于PCR6.逆转录酶：AWV (源于鸟成髓细胞白血病病毒)，Mo-MLV(源于Moloney鼠白血病病毒)活性：(1)53聚合酶活性(2) RNaseH活性(Mo-MLV 小,cDNA得率高)主要用途：(1)反转录cDNA(2) 标记5突出端（补平）(3) 测序7.末端转移酶作用:在DNA或RNA3羟基上加dNTP主要用途：(1)载体或cDNA加同聚尾(100nt)(2)DNA的3OH同位素标记三. 激酶T4多聚核苷酸激酶催化ATP的 -磷酸基到DNA或RNA的5 OH主要用途: DNA的5OH同位素标记(寡核苷酸)四.连接酶T4 DNA连接酶连接：粘端，平端，d
9、sDNA中的切口，杂交体连接五.碱性磷酸酶包括细菌碱性磷酸酶(BAP)和小肠碱性磷酸酶(CIP), 虾碱性磷酸酶(SAP)用途:去除DNA、RNA、NTP、dNTP的5磷酸根六.核酸酶1.DNA酶为DNA内切核酸酶,水解单链或双链用途:(1)缺口平移标记探针时产生随机切口(2)降解DNA2.RNA酶内切核糖核酸酶,专用降解RNA3. S1核酸酶作用:降解单链DNA或RNA(酶量小)降解双链DNA(酶量大)用途:(1)去除DNA突出端,切为平头(2)打开cDNA发夹结构4.外切核酸酶III(ExoIII)作用:从双链 DNA3OH 逐一降解单核苷酸不降解单链DNA或3突出的从双链DNA用途:系列缺失亚克隆
