第四章食品中有害微生物快速检测

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1、第四章 食品中有害微生物快速检测方法食品微生物污染是指食品在加工、运输、储藏、销售过程中被微生物及其毒素污染。食品微生物的污染主要包括细菌及细菌毒素污染和霉菌及霉菌素的污染。食品中的细菌包括致病菌、相对致病菌和非致病菌。从食品安全的角度看，对致病菌的检测尤为重要。下表列出的为常见细菌致病菌。芽孢孢杆菌属（Bacillus）B. cereus蜡样样+ 兼性厌厌氧产产生下痢性毒素、肠肠毒素、溶血素、呕吐毒素等。梭菌属（Clostridium）C. botulium肉毒+ 兼性厌厌氧产产生肉毒素，全身乏力、头头痛、头头昏直至死亡。李斯特菌属（Listeria）+ 兼性厌厌氧引起人和动动物脑脑膜炎、败

2、败血症及孕妇妇流产产等。弯曲杆菌属（Campylobacter）- 微需细细菌性肠肠炎，下痢、腹痛、发热发热 、恶恶心、呕吐等肠肠 杆 菌 科埃希氏菌属 （ Escherichia ）-兼性厌厌氧人和动动 物肠肠道 内E. coli绝绝大多数在肠肠道内无 致病性，但该该菌污污染 食品后，具有组组氨酸 脱羧羧酶活性，产产生 组组胺，引起过过敏性中 毒，常作为粪为粪 便污污 染指标标菌之一 志贺贺氏菌属 （Shigella）-兼性厌厌氧下痢、发热发热 、腹痛沙门门氏菌属 （ Salmonalla ）-兼性厌厌氧广泛分 布于自 然界有些对对人有害，有些 对动对动 物有害，有些 对对人和动动物皆有害，

3、 引起急性肠肠胃炎和败败 血症等 耶尔森氏菌 属 （Yersinia）Y. enterocolitica 小肠结肠肠结肠 炎耶 尔森氏菌-兼性厌厌氧广泛分 布于自 然界肠肠胃炎弧 菌 科弧菌属 （Vibrio）V. parahaemoly ticus副溶血-兼性厌厌 氧淡、海 水和鱼鱼 贝贝腹痛、下痢、呕 吐等典型的急性 肠肠胃炎 V. cholerae霍 乱 微 球 菌 科葡萄球菌 属 （ Staphyloco ccus）S. aureus金 黄色+兼性厌厌 氧动动物及 人的体 表、垃 圾和人 类类生活 环环境产产生毒素，引起 食物中毒，感染 人或动动物后，引 起化脓脓性疾病、 肺炎、败败血

4、症等 。第一节 微生物数量的快速检测食品中细菌数量的卫生需意义在于作为食品被微生物污染程度的标志。大肠菌群的卫生学意义在于作为食品受粪便污染程度的标志，同时肠道致病菌如沙门氏菌和志贺氏菌是引起食物中毒的重要致病菌，然而对食品经常进行逐批检查又不可能，鉴于大肠菌群与肠道致病菌来源相同，所以大肠菌群的另一重要食品卫生学意义是作为肠道病原菌污染食品的指示菌。食品中微生物数量，传统方法往往需要将微生物培养成肉眼可见的菌落才可确认，所以比较麻烦，现行国家标 准（2010版）中关于菌落总数、霉菌总数、酵母菌总数皆是采用传统培养方法进行检测，下面介绍一些较为快速的检测方法。一、旋转平皿技术法（SPLC, s

5、piral plate count）适度稀释的样品经螺旋平板注入器入计数平板，在琼脂表面形成阿基米德螺旋轨迹，空心针从样品中心向边缘螺旋移动，菌液被自动稀释，菌落沿注液线生长，通过计数器自动数菌落数或通过计数板人工计数，再换算成样品中的微生物数量。2、特点（1）优点：如果样品中微生物数量在500-50000之间时，样品除了在称样后稀释一次外，不需另再稀释，可直接涂布计数。节省了劳力和工具。 （2）缺点：与传统方法相比，培养时间没有缩短。二、疏水性栅格滤膜法（HGMF, hydrophobic grid membrane filter）或等格法(isogrid method)用疏水性栅格滤膜过滤

6、样品，然后把截留住微生物的滤膜置于固体培养基中培养，观察微生物的数量，疏水性 的栅格防止菌落扩散，比如SN/T 1606-2005 进出口饮料中菌落总数、大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌技术方法中采用了这一方法，只是根据需要测定的对象，选择的培养基不同而已。 在AOAC分析方法中，也用于测定食品中霉菌和酵母菌的总数。三、皿膜系统（petrifilm）双层膜系统内含有干燥的营养物质（类似平板技术琼脂或其他选择性培养基成分）和冷水可溶的胶体物质，将 样品加到基础膜中间，盖上还有胶凝剂和TTC的覆盖膜，培养后微生物在双层膜之间生长并显色即可直接计数 。该方法主要在AOAC系列方法中用于检测牛奶及制品中

7、的细菌和大肠菌群计数，霉菌及酵母菌计数。2008年时也是国标，2010年版中删除了此法。四、阻抗法（impedence measurement）阻抗法是20世纪70年代初期发展起来的一项新技术，是用电阻抗作为媒介，检测微生物代谢活性为基础的一种 快速方法。也是SN/T 1749-2006 鲜乳中菌落总数快速测定采用的方法。微生物生长代谢将培养基中蛋白质和碳水化合物转变为氨基酸及乳酸等，引起培养基电阻抗微弱变化，可有阻 抗检测仪器记录成DT值（detect time），而该值与样品微生物污染程度在一定范围内存在相关关系。建立DT值与菌落总数之间的标准曲线及回归方程。利用回归方程 ，测定样品DT值

8、，计数出样品菌落总数。五、ATP生物发光技术所有活的细胞内存在ATP,在细胞死亡2h后消失。食品加工厂，ATP检测技术可以对清洗和消毒的效果做出快速评价。ATP存在可能是由于食物残留，也可能是因为有活的细菌存在。因此ATP存在状况都反映出食品加工厂的卫生情况是比较差的。 在有ATP和氧存在的条件下，荧光素酶和底物反应发光。第二节 有害微生物的快速检测技术 一、有害微生物的增菌培养 有害微生物在食品中数量相对较少，要对其检测，首先 应对其增菌培养。 增菌培养的方式通常使用选择性培养基对靶微生物进行 增殖。 但对一些加工食品，在增菌培养前，常需要预增菌培养 ，预增菌培养时选择的是一些富含营养物质的

9、非选择性 增殖。 增菌培养后的有害微生物通常涂布于选择培养基上，根 据菌落形态、色泽等菌落特征对其进行可疑菌落筛选。 下面以沙门菌为例：1、非选择性富集选用胰蛋白胨大豆肉汤（TSB，Trypticase (Tryptic) Soy Broth）可满足微生物的生长，而乳糖肉汤（LB）可用于大肠杆菌以及肠杆菌科其它种属微生物的前增菌。 2、选择性富集选用亚硒酸盐胱氨酸（SC，Selenite Cystine）肉汤：亚硒酸钠作用在于抑制大肠杆菌的生长，胱氨酸用于促进沙门氏菌的生长。连四硫酸盐（TT, Tetrathionate,）肉汤：蛋白胨、胆盐、硫代硫酸钠、碳酸钙、吲哚。吲哚与硫代硫酸钠生成连四

10、硫酸盐，该物质允许沙门氏菌生长同时抑制大肠杆 菌生产，胆盐可以抑制G+的生长和存活，碳酸钙提供缓冲效果。3、选择(或鉴别)培养硫酸铋（BS）琼脂：用于肺炎沙门氏菌及沙门氏菌属中其它种的分离，硫酸铋和亮绿是主要的选择性成分，能够允许沙门氏菌生 长的同时抑制G+的生长和存活，硫酸铁的目的在于能够在一定条件下生成硫化氢，硫化氢使沙门氏菌细胞表现出黑色或灰绿色。 木糖-脱氧胆盐（XLD，Xylose lysine deoxycholate）琼脂：脱氧胆盐抑制G+生长，沙门氏菌能迅速发酵木糖，促进赖氨酸发生脱羧并导致周围碱性环境，沙门氏菌在碱性条件下呈红色，碱性条件下硫化氢生成，沙门氏红色菌落中间出现黑

11、色。 培氏肠道细菌（HE ，Hektoen）琼脂：溴百里酚蓝和酸性品红的存在，沙门氏菌不发酵乳糖，因此呈现蓝色或蓝绿色，硫代硫酸钠和柠檬酸铁氨在一定条件下生成硫化氢，而硫化氢使沙门氏菌呈黑色。二、常用的快速检测技术概述序 号名称原理备备注1 化 学 法显显色培 养法将食品增菌后（非选择选择 性富集和 选择选择 性富集），置于鉴别鉴别 培养基 上，利用细细菌的特有生理生化反应应 ，使培养基中的指示剂产剂产 生颜颜色 变变化，以将目标标菌与其他菌区别别 开来。（petrifilm原理与此类类似）GB/T4789.32- 2002大肠肠菌群 的快速检测检测2 免 疫 法ELISA包被抗 体酶底物产产

12、物特点AOAC 993.08 AOAC 989.14 AOAC 989.15 SN/T 1059.6-2008 GB/T 22429-2008 （沙门门氏菌、肠肠 出血大肠肠埃希氏 菌O157及单单核细细 胞增生李斯特氏 菌）单单克 隆或多 克隆HR P AP四甲基联联苯胺二聚体 有色物质质（450nm） 4-甲基伞伞形磷酸酮酮(4-MUP ，4-methylumbelliferyl phosphate)4-甲基伞伞形 酮酮荧荧光性 磷酸酚酞盐酞盐 （PMP, phenolphthalein monophosphate）酚酞酞 有色物质质(550nm) 免疫磁 珠法将直径0.05-4m具有磁性

13、的微珠表面化学 修饰饰，并与微生物特异性抗体结结合，制成 免疫磁珠，它能与食品中有害微生物抗原 结结合，利用磁性将免疫磁珠 聚集，经经清洗 后接种到选择选择 培养基上进进行验证验证 。SN/T0184.3-2008 单单核细细胞增生李 斯特氏菌检测检测 SN/T 1059.5-2006 大肠肠杆菌O157的 检测检测 方法 乳胶凝 聚法聚苯乙烯烯乳胶颗颗粒上包被有有害微生物的 抗体，可疑菌落挑取至上面时时有凝聚现现象 。3 分 子 生 物 学 方 法PCR法样样品中沙门门氏菌经经增菌后，溶解提取DNA，PCR扩扩增 ，DNA分子量标记标记 物作参照，阴性对对照不出现现条带带， 如测样测样 品出

14、现现相应应大小扩扩增条带则带则 可判定该样该样 品结结果 为为可疑阳性。SN/T 1869-2007 (沙门门氏菌、志贺贺氏菌 、金黄色葡萄球菌、小 肠结肠肠结肠 炎耶尔森氏菌、 单单核细细胞增生李斯特氏 菌、空肠肠弯曲菌、肠肠出 血大肠肠埃希氏菌 O157:H7、副溶血性弧 菌、霍乱弧菌、创伤创伤 弧 菌) real time PCR加入一条与模板DNA匹配的、两端有荧荧光基团标记团标记 的 寡核苷酸探针针，PCR每进进行一次循环环，合成的新链链数与 释释放的荧荧光基团团呈对应对应 关系，即PCR产产物的量与荧荧光 信号的强度呈对应对应 关系。SN/T 1870-2007（沙门门 氏菌、志贺贺氏菌、金黄 色葡萄球菌、小肠结肠肠结肠 炎耶尔森氏菌、单单核细细 胞增生李斯特氏菌、空 肠肠弯曲菌、肠肠出血大肠肠 埃希氏菌O157:H7、副 溶血性弧菌、霍乱弧菌 、创伤创伤 弧菌、溶藻弧菌 ）4 物 理 法自动动化 传导传导 法样样品中沙门门氏菌经预经预 增菌，然后 在含有三甲胺-N-氧化物及卫卫茅醇 的培养基和赖赖氨酸亚亚硒酸盐盐基础础 培养基中进进行传导检测传导检测 ，与非沙 门门菌相比，典型的沙门门氏菌在这这2 种培养基上产产生大量的电导变电导变 化 。AOAC991.38 根据培养基的 不同，还还可以 用于检测检测 大肠肠 杆菌、李斯特 氏菌、弯曲杆 菌等。