无菌检查法验证

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1、无菌检查法验证张荣玉一、概述： 1.1 定义：系用于检查药典要求的无菌的药品、医疗 器具、原料、辅料及其它品种是否无菌的一种方 法。 2.1验证的必要性和意义：确认所采用的方法检查供试品无菌的适合性 。保证检查结果的准确性、可靠性、准确性和 重现性；检查方法的完整性。与同药品无菌检查接轨。通过对不同品种、批号的无菌检查比较；对 产品生产全过程进行质量监控。二、存在问题:2.1 专业人才少,缺乏相应的培训和管理。 2.2 工作量大,导致操作不规范。 2.3 检验方法缺陷，如直接种法可操作性差，引入 污染的风险较大。 2.4 试验条件的影响环境影响培养基、稀释剂、冲洗液。所用品、器具清洁灭菌。三、

2、无菌检查的试验要求: 3.1 环境：10000级局部以下100级，布局符合无菌 操作要求；或隔离系统（生物安全柜）。 3.2 人员：必须具备微生物专业知识，并经培训。 3.3 设备、器件、材料：经处理必须符合无菌要求， 培养箱的温度指示装置要校验。 3.4 培养基： 3.4.1 按药典规定处方配制，采用经验证合格的灭菌程序 灭菌。 3.4.2 保存：2-25 避光保存；期限：非密闭容器3周， 密闭容器1年。 3.4.3 培养基适用性、无菌性、灵敏度检查。3.4.4 灵敏度检查： 3.4.4.1检查用菌株传代不得超过5代。 3.4.4.2常用菌株：l金黄色葡萄球菌（CMCC(B)26003)l铜

3、像假单胞菌CMCC（B）10104l枯草芽胞杆菌CMCC（B）63501l生孢梭菌CMCC（B）64941l白色念珠菌CMCC（F）98001l黑曲霉CMCC（F）98003 3.4.4.3菌液配制、保存、接种培养按药典要求。 3.4.4.4结果判断：空白对照应无细菌增长，加菌液的培养基管均 生长良好，培养基灵敏度符合要求。3.5 稀释液、冲洗液： 3.5.1 按药典规定配制后采用经验证的灭菌程序灭菌 。 3.5.2常用稀释液、冲洗液：l0.1%蛋白胨水液lPH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液l无菌0.1%氯化钠液l中性磷酸盐缓冲液l含0.1%聚山梨酯（吐温-80 ）的0.1%蛋白胨水溶液 3.5.

4、3 依据供试品的特性选择稀释液、冲洗液。四、无菌检查法验证:4.1 原理:验证的所有环境、培养基、菌株、稀释液 、冲洗液均与日常检查方法相一致、并符合相关 规定。 4.2 验证分类：前验证：建立无菌检查方法时。再验证：修订检查方法时。定期验证：供试品组合或原检查条件改变。4.3 验证方案制定原则：供试品的抑菌性，敏感菌种选择;适当的方法消 除或降低抑菌性。样品的预处理方式能有效抵消（或中和）产品的 抑菌性。样品的预处理方式、检验过程、培养条件均不影 响样品中微生物的生长。验证记录真实完整地记录所做试验。4.4 验证重点环节分布：样品需前处理不需前处理验证前处理方法对污染菌生长，检出影响有抑菌作

5、用去除抑菌作用通过验证 实验判无抑菌作用验证抑菌活性去除方法的有 效性及对污染菌检出物影响检验4.5 验证方法： 4.5.1 制备验证试验菌液，按药典方法配制菌液。 4.5.2 选择配制适合的培养基、稀释液、冲洗液。 4.5.3 供试品的处理：验证所用的溶解剂、稀释剂、助溶剂、破乳剂等 的有效性，使用量及微生物生长无影响。验证加热温度、离心速度和时间对微生物生长或 分布无影响。不需前处理的供试品免做。4.5.4 无抑菌性样品的验证方法：依据产品溶解性和 微生物限度选择合适的中性稀释剂溶解和稀释， 用直接接种法验证，常用中性稀释液或淋洗液。 4.5.5 具有抑菌性样品的验证方法：确定抑菌作用（抑

6、细菌、真菌试验验证），选择 敏感菌株对供试品抑菌活性去除效果检验（阳性 菌回收试验）。消除样品抑菌性的方法验证：a)化学钝化中和法（化学试剂中合法）：利用化学 （生物）专属性灭活，常用钝化剂有：对氨基苯 甲酸、卵磷脂、聚山梨酯-80等。薄膜过滤法和 直接接种法也可用。对化学中和剂不敏感的样品 ，用酶中和，如 -内转氨酶。b)稀释中和法：利用降低供试品的相对浓度，将样 品稀释至最低抑菌浓度下进行。c)薄膜过滤法：利用体积差异分离，通过薄膜过滤 ，微生物被截于滤膜，培养薄膜观察有无微生物 生长。各方法组合运用，效果更好。 验证方法: a.验证分组： lA组:样品组,适当方法中和样品,加入少量验证微

7、 生物(接种量少于100cfu)。lB组:对照组,0.1%蛋白胨或PH7.0无菌氯化钠蛋 白胨缓冲液,加少量微生物(接种量少于100cfu).lC组：阳性对照组，不经中和处理，将实验菌株 直接接种于培养基中(接种量少于100cfu)。b.结果分析:A组与B组微生物生长数量相似，表明中 和剂的中和方式有效消除了样品的抑菌性，如果B 组与C组的微生物数量相似，表明样品预处理用中 和剂的毒性、检测程序和培养条件等均不影响微 生物生长。样品如无抑菌性，省去B组试验，A组 与C组直接比较。A组微生物生长数量不及C组微 生物生长数量，表明试验用器具材料或培养条件 等方面存在对微生物生长不利因素。 c.为考

8、查验证方法的稳定性和重现性，验证至少需3 个不同批次的同类样品，分别进行3次验证实验。五、供试品无菌检查验证: 5.1 按药典要求确定检验数量、检验量、设立阳性对 照和阴性对照。 5.2供试品无菌检查方法和检验条件与验证方法相同 。 5.3直接接种法验证试验： 5.3.1 供试品有抑菌时，按培养基灵敏度试验的菌种，向该种 无菌检查培养基内加入该微生物，每种培养基接2瓶，每 瓶接种量控制10-100cfu之间。 5.3.2 参照药典规定确定培养基用量，按无菌检查要求向上 述其中一瓶加入规定量供试品，另一瓶为阳性对照。 5.3.3 将种好的容器按药典规定温度培养14 days。5.3.4 验证结果

9、评价：供试品与阳性对照相比、供试品容器内微生物生长不明显 ，说明有抑菌性。可使用中和剂如比温-80。 -内酰胺酶 等消除抑菌效果。中和剂不能消除抑菌作用，适当增加培 养基体积稀释。 5.4 薄膜过滤法验证试验： 5.4.1 薄膜过滤法验证试验供试品有抑菌特性时，在同型号的 每个过滤器加规定定量的供试品（容器数及每容器的过滤 体积）。淋洗至少3次，淋洗液为100ml/次，最后一次淋 洗液中，接种验证用菌株（10-100cfu）；取另一滤器不过 滤供试品，重复上述淋洗操作，作为阳性对照。分别将灵 敏度实验的菌种及相应培养基逐一试验。5.4.2 供试品和阳性对照接种后、培养基容器按药典菌株要 求温度

10、下培养，时间不超过14days。 5.4.3 使用新的滤膜过滤器（不同厂家或批号、型号）重新 进行样品试验组、蛋白胨对照组和阳性对照组的验证确认 。 5.4.4 验证结果评价：供试品培养基容器内可见微生物生长明显（混浊），与 阳性对照组比较结果相似，则在无菌检查试验中必须过 滤与验证试验相等量的供试品、淋洗液。淋洗相同次数 及使用相同量的培养基。供试品培养基容器内与阳性对照结果相比微生物生长不 明显，应增加淋洗次数、重复上述试验。六、验证合格标准: 6.1平皿菌落计: 6.1.1 通常用于药品防腐剂防腐效力测试和微生物限 度检查中。计数每毫升（或克）样品的微生物含 量。 6.1.2 每种试验菌

11、每组至少重复3次（3个不同批次的 样品）。 6.1.3 合格标准：A组（样品试验组）验证微生物平 均生长数量不低于C组（阳性对照组）验证微生物 平均生长数量的70%，检验方法通过验证。6.2 直接接种法： 6.2.1 培养基能中和抗菌剂的抑菌性，并适合广谱微 生物的生长，包括样品种潜在微生物生长。 6.2.2 每种试验菌种每组实验至少独立重复3次。如 需要改变产品和培养基比率达到中和效果。 6.2.3 合格标准：3批（不同批次的样品）在14days 内所有样品试验组中培养基都显示大量的微生物 生长，则相应的试验方法通过验证。6.3 薄膜过滤法： 6.3.1 适用于无菌检查和生物限度坚查，样品必

12、须能 被过滤。需溶解的样品应验证该样品的溶解方式 及整个试验过程，试验用具和材料及培养条件等 不会影响样品中固有的微生物的生长。 6.3.2 样品试验组、样品溶液通过薄膜，用适量淋洗 液淋洗3次，在最后一次淋洗液中接入少量（10- 100财富）验证菌。淋洗后，将滤膜转移到固体培 养基（或液体培养基中）培养。样品抑菌性强、 则应进行中和处理，再验证中和效果。6.3.3 蛋白胨对照组：不加产品的稀释液，其他操作及 实验条件与样品试验组相同。验证中和用钝化剂（针 对需预处理的样品）、过滤器和滤膜材质是否会对微 生物产生影响）。 6.3.4 阳性对照组：将与上述两组等量同种验证菌液（ 10-100cf

13、u）直接种到固体培养基表面（或液体培养基 中）。比较蛋白胨对照组和阳性对照组微生物的情况 ，估算滤器和滤膜造成微生物的损失量。 6.3.5 3次试验（3个不同批次的样品）结果评价：上述 3组试验结果间差异均在70%以上（固体培养基）或 培养14days内所有试验组的液体培养基微生物均有生 长，则认为验证微生物的回收率基本相同，相应的微 生物验证方法同过验证。七、验证试验结果的评价与报告: 7.1 分析评价主要包括有： 7.1.1 对每个验证试验的菌株、每次验证试验的数据 及其有效性和合理性评价。 7.1.2 验证试验数据所表明的检品预处理方式、检验 用器具、材料、培养条件等的合理性是否符合规

14、定要求，它们与药品检验的规程要求是否符合。 7.1.3 验证试验数据最后要说明该药品的微生物检测 方法是否准确、有效、可靠与可行，是否有较好 的重现性。最后得出结论。7.2 验证试验报告内容包括有： 7.2.1 验证试验药品的名称，待验证检验方法的有效登记 号。 7.2.2 验证试验用菌株名称、菌号、试验室控制号、转 种代数。 7.2.3 验证菌株的制备和接种记录。 7.2.4验证供试品的预处理方法、检验用具和材料、检测 步骤以及培养条件等。 7.2.5 验证试验结果的评价及结论。 7.2.6 验证条件：包括验证试验的原始记录，包括验证 菌株的制备和接种量复核、验证试验结果等。无菌验证范例（注

15、射剂无菌检查方法）一、材料： 1.1 样品：品名、规格、批号、生产批号。 1.2 培养基稀释液：硫乙醇酸盐液体培养基、批号；改 良马丁液体培养液，批号；营养肉汤培养基，批号； 营养琼脂培养基，批号；0.1%蛋白胨涤养，PH7.1 0.2；培养基和稀释液来源。 1.3 验证试验用菌种：所用菌代数。金黄色葡萄球菌（ 26003）；铜绿假单胞菌（10104），枯草芽孢杆菌 （63501）;生孢梭菌（64941）；白色念珠菌（ 98001）；黑曲霉菌（98003），上述菌种的来源及 传代数。 1.4 仪器和滤器：HTY-2001A集菌仪；全封闭无菌试验 过滤培养器，批号及生产厂商。二、验证方法： 2.

16、1 菌液制备：取经34培养18-24h的金葡萄、铜绿假单胞菌，枯草孢芽菌 的新鲜肉汤培养物1ml，加入无菌0.9%氯化钠溶液9ml，10倍 稀释至10-5 、10-7均为50-100cfu/ml，备用。取经34培养18-24h的生孢梭菌硫乙醇酸盐液体培养物1ml。 加入无菌0.9%氯化钠溶液9ml， 10倍稀释至10-7均为50- 100cfu/ml，备用。取经24培养的白色念珠菌改良马丁液体培养物1ml，加入无 菌0.9%氯化钠溶液9ml， 10倍稀释至10-7均为50-100cfu/ml， 备用。取经24培养一周的黑曲霉料面培养物，加入无菌0.9%氯化 钠溶液10ml，洗下孢子；吸出孢子悬液，过滤除去菌籽，收 集菌液至另一无菌试管，取菌液0.1ml，加入无菌0.9%氯化钠 溶液9.9ml，稀释至10-7均为50-100cfu/ml，备用。2.2 菌液计数：每种菌液接种工作皿、取平均值。计数结果 列表（略） 。 2.3 方法验证及结果：直接种法：取样品12支，分别接种8支硫乙醇