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1、疯牛病及其检测规范刘雨田国家牛海绵状脑病参考实验室 中国动物卫生与流行病学中心 2008年5月两个参考实验室：国家新城疫参考实验室国家疯牛病参考实验室外来病：小反刍兽疫、尼帕病、西尼罗河热 、裂谷热、水泡性口炎、羊痒病、疯牛病、结节性皮肤病、C型口蹄疫等国家外来动物疫病诊断中心一、疯牛病的历史n1986年首次在英国确诊n1988年基本摸清疯牛病的发病原因和流行情况n1990年我国农业部发出严防疯牛病传入我国的 通知n1992年和1993年疯牛病发病率达到高峰n1996年确诊第一例人疯牛病（nvCJD）n2001年疯牛病首次在亚洲的日本发生n2003年疯牛病首次在北美的加拿大发生n2005年疯牛
2、病首次在北美的美国发生n2008年，疯牛病还在发生，只是数量不多二、定义疯牛病（BSE），学名为牛海绵状脑病，是成年牛的一种致死性渐进性神经性疾病。它是一个新病，也是第一个人造动物病。它与人的克雅氏病（CJD）、库鲁病（Kuru）以及绵羊痒病（Scrapie）等统称为传染性海绵状脑病（TSE）。三、BSE病原朊毒体（PrPSc ）n源于肉骨粉中的痒病因子n一种奇特的蛋白质 Prion，宿主神经元表面正 常朊蛋白的异构体n感染动物不会产生免疫应 答反应n能抵抗PK酶的消化n很难灭活n无株系差异（？） 正常异常PK消化 溶于DD 螺旋 折叠PrPC 是 是 40% 约3%PrPSc 否 否 30%
3、 45% PrPSc对一般的物理化学消毒方法具有极强的抵抗力 最有效的杀灭方法是焚烧；134-138蒸汽高压消毒 ，18分钟；此外，含有效氯的次氯酸钠及的 氢氧化钠，20oC、1小时以上用于表面消毒免疫学 检测的 基础、潜伏期2年或更长，平均为3年 、发病率感染牛群的发病率在3%以下 、感染来源痒病病羊或BSE病牛，制成的肉骨粉(MBM) 、传播途径主要通过饲料传播，无水平传播和垂直传播的证据，但在疫病防控中要考虑四、流行病学PrPScPrPScPrPScPrPScnvCJD有机溶剂& 134 少量PrPSc、易感动物）牛科动物家牛、野牛等与痒病不同，无遗传易感性的差异奶牛多发，因奶牛存养时间
4、比肉牛长）猫科家猫、虎、豹、狮等）实验感染牛、猪、绵羊、山羊、鼠、貂、猴鸡不发病、BSE 发生流行的三个要素）存在大量绵羊且有痒病流行或从痒病、BSE发病国进口了污染朊毒体的动物组织或肉骨粉）肉骨粉加工方法不能灭活朊毒体）用这种肉骨粉喂牛国外某肉骨粉加工厂我国某骨粉加工厂7、病例分布n英国（97%）n欧洲其他大部分国家n亚洲日本、以色利n北美洲加拿大、美国n中国？我国从BSE发病国进口肉骨粉的情况(吨)荷 兰英 国日 本1996年至2001年去向不明97%BSE 25国五、发病机理回肠陪氏淋巴结口服DC中复制（1）脾DC中复制（2）肠神经丛腹腔注射中枢神经迷走神经? SOD活性下降 抗氧化功能
5、降低海绵状脑部病变神经症状六、病原在机体内的分布(SRM)外周神经？七、公共卫生1、食物：污染BSE病原的食品；2、医源性：手术、牛源性医疗器械、药品；3、化妆品：口红（污染BSE）；八、其他影响n经济方面英国：超过百亿英镑；美国：60亿美元；加 拿大：40亿美元。n社会方面恐慌，不肯吃肉牛等n政治方面英国农业部部长下台、德国农业部和卫生部 部长下台、日本农水省官员受处分。 。 BSE成为政治问题贸易谈判九、国际BSE有关情况介绍n发达国家的BSE检测数量惊人nOIE正在推进BSE风险等级认证：检测数量 要换算成监测分数值Table 1. Points targets for differen
6、t adult cattle population sizes in a country, zone or compartmentPoints targets for country, zone or compartmentAdult cattle population size (24 months and older) （头）Type A surveillanceType B surveillance1,000,000300,000150,000800,000-1,000,000240,000120,000600,000-800,000180,00090,000400,000-600,00
7、0120,00060,000200,000-400,00060,00030,000100,000-200,00030,00015,00050,000-100,00015,0007,500（分数值）（分数值）Table 2. Surveillance point values for samples collected from animals in the given subpopulation and age categorySurveillance subpopulationRoutine slaughter2.Fallen stock3.Casualty slaughter4.Clini
8、cal suspect5.Age 1 year and 2 years and 4 years and 7 years and 9 years (aged)0.00.10.245（不同亚群与年龄段的分数值）十、我国BSE 检测规范、临床诊断、鉴别诊断、实验室诊断1、临床诊断发病初期 非常隐蔽，不易察 觉。 主要表现为走路落 伍、不愿过水泥地和 门槛、挤奶时踢腿、 反刍减少、走路时高 抬后腿、逐渐消瘦。发病后期食欲不振、明显消瘦、行走时左右摇摆、 易倒地并且起来困难、怕光、怕触摸、怕刺耳 的声音、经常甩头、具有明显的攻击性、时有 瘙痒、颤抖、踢腿明显、神经症状明显、不愿 过障碍物2、鉴别诊断）有
9、机磷农药中毒）低镁血症）神经性酮病）李氏杆菌病）脑灰质软化或脑皮质坏死）脑内肿瘤）脑内寄生虫病）狂犬病9）其他脑病3、实验室诊断1）组织病理染色法（HE染色）方法确实，80-90%，经验2）免疫组化检查PrPSc，确诊，OIE规定的“金标准”3）Western-blotting检查PrPSc，辅助确诊，昂贵4）ELISA筛检方法，简便快速、价格昂贵5）动物接种实验脑内接种转基因鼠，70天左右潜伏期临床表现 临床可疑、紧急屠宰、病死牛 年龄 4-7岁为主 品种 奶牛为主，肉牛为辅尽量在奶牛场采样样品要求n临床可疑牛：n1一般可疑： 行为改变，如落伍 像拉马车样低头站立 过度舔舌 n经常伸展脖子
10、耳朵竖立 失明 磨牙 n2中度可疑： 没有外伤或感染而濒临死亡 斜靠着物体才能站立 n瘫痪/局部麻痹 颤抖 走路时后肢过度摇摆 意识异常 转圈运动 倒地 踢腿 兴奋 狂怒 胆怯 恐惧 共济失调 n3高度可疑： 感觉过敏如听觉、触觉、视觉 面对舍门或障碍物犹豫不前 不愿进挤奶室 挤奶时持续踢踏 走路时后肢过度伸展 n紧急屠宰牛：n倒地不起 不愿行动 严重伤病 宰前检验认为要销毁的牛 其他 n死畜：n在农场病死的 在运输过程中病死的 在其他地方病死的 第一对恒齿长齐24月龄 与30月龄之间乳齿-小于24月龄三颗恒齿-30月龄两对恒齿-大于30月龄永久门齿门齿 生长长情况对应对应 年龄龄第一对永久门
11、齿长 出2岁第二对永久门齿长 出3岁第三对永久门齿长 出4岁第四对永久门齿长 出(齐 口)5岁前三对永久门齿齿 面重磨 ，第四对永久齿也出 现磨损6岁第一对永久门齿齿 面呈方 形7-8岁第二对永久门齿齿 面呈方 形8-9岁第一对永久门齿齿 面呈圆 形，第三对永久门齿 齿面呈方形9-10岁第一对永久门齿齿 面呈三 角形，第四对永久门 齿齿面呈方形11岁第二、三、四对永久门齿 齿面呈三角形12岁以上的老牛采集牛脑采样勺法物品准备：采样单、手套、 剪刀、口罩、工 作服、样品杯、 记号笔或铅笔、 冰袋、大号透明 胶带、带盖泡沫 箱、签字笔或圆珠笔、吸水纸 脑硬膜延脑冷冻样品先以ELISA方法筛检， 然
12、后确诊用IHC方法采集牛脑电锯法甲醛固定的全脑只能以 IHC方法和HE染色检测Obex采样存在的问题n健康牛的比例太大n采集部位不对n采样单填写不详细n样品冷冻程度不够实验室检测组织病理学方法(HE)常规的HE染色耗时较长，从组织固定到观察结果至少10天结果判断较难，要丰富的经验确诊率不高，需要结合其他免疫学方法观察空泡变化，有时没有典型的空泡病变- 神经元和神经纤维网浆常用的仪器设备简单但耗时，价格低廉简明步骤取材透明甲醛固定脱甲醛脱水浸蜡包埋切片烤片脱蜡苏木精染色伊红染色透明封片观察结果免疫组织化学方法(IHC)核心技术：单抗OIE规定为“金标准”确诊方法从组织固定到结果判断耗时至少10天
13、参考实验室必须熟练掌握的技术常用的仪器设备工作量大方法简单但耗时，价格低廉，操作要仔细简明步骤取材透明甲醛固定脱甲醛脱水浸蜡包埋切片烤片脱蜡PK酶消化封闭单抗孵育ABC试剂孵育观察结果封片（1为孤束核疯牛病，2为三叉神经第 五束核，3为迷走神经背核痒病） HE染色HE染色IHC染色IHC染色空泡空泡紫红色颗粒紫红色颗粒ELISA方法商品化的试剂盒，通过欧盟认证各种产品的检测原理基本一致结果准确，快速，价格贵筛检方法，确诊时需结合免疫组化或免 疫印迹方法IDEXX BSE EIA免疫印迹方法(WB)商品化的试剂盒，通过欧盟认证也可以自己建立稳定的WB方法检测原理结果准确，快速，价格贵确诊方法简明步骤n灌胶n样品处理 n电泳 n电转移 n化学发光检测 n分析结果 十一、防范内查外堵BSE和痒病监测、强制报告、风险 分析评估、饲料监管禁止进口来源于BSE和痒病发 生国的活牛羊及其相关产品宣传通告报刊杂志 电台、网络、培训、会议 （一类动物疫病）农业部、卫生部、海关总署、国 家质量监督检验检疫总局、国家 食品药品监督管理局、国家出入 境检验检疫局等（三十多个法规 ）
