《制药092第二组》由会员分享，可在线阅读，更多相关《制药092第二组（32页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、西瓜细胞核雄性不育系雄花 蕾的mRNA 差异表达分析生物技术093第二小组摘要：为阐明西瓜G17AB 系雄性不育发 生的分子机制，采用mRNA 差异显示技术，分 析了不育株与可育株雄花蕾发育过程中基因表 达的差异，经重复验证，获得了2 个稳定表达的 差异cDNA 片段: C13F 和G10S。经克隆测序和 同源性分析，C13F 片段与拟南芥-葡萄糖苷酶 酶蛋白的部分编码序列具有80同源性；G10S 片断与菜豆泛素mRNA的编码序列具有92%同 源性。关键词： 西瓜； 细胞核雄性不育； mRNA 差异显示前言植物花粉发育的分子生物学，已经成为植 物分子生物学研究中的热点领域。在花粉的发 育过程中
2、，涉及近万种特异基因的表达，但目 前已鉴定的花粉发育特异基因不过几十种1。 因此，研究花药、花粉在发育过程中基因表达 的时空特异性，分离相关特异基因和特异启动 子，对于认识植物花粉发育的分子机理具有重 要意义。 Liang 等2在1992 年首先建立的mRNA 差 异显示技术，为研究基因表达调控提供了 一种简便有效的方法。这种方法克服了以 往鉴别基因差异表达方法如减法杂交和差 异杂交等存在的实验周期长、操作复杂、 效率低、费用高等缺点，被各国学者广泛 采用并不断改进，应用于与生物发育密切 相关的许多领域。1988 年，夏锡桐等3在龙蜜100 号西瓜 自交后代中发现了雄性不育株并选育G17AB
3、雄性不育两用系，此后有关西瓜雄性不育材料 的发现及研究报道较多，主要集中在细胞形态 、生理生化和分子标记等方面4-6，而有关不 育和可育基因表达差异的研究罕见报道。西瓜 G17AB 细胞核雄性不育两用系经过多代系内 自交，不育株与可育株具有相同的遗传背景， 两者仅雄花表现不同育性，是研究育性基因时 空表达的理想材料。本实验室在对西瓜G17AB 细胞核雄性 不育两用系的细胞形态、生理生化和分子 标记研究的基础上，采用mRNA 差异显示 技术，对西瓜G17AB 细胞核雄性不育两用 系的可育株与不育株雄花蕾发育过程中的 基因表达差异进行研究，以期阐明西瓜细 胞核雄性不育发生的分子机理。1.材料和方法
4、 1.1 材料 春季将西瓜G17AB 细胞核雄性不育两用系 定植于日光温室内，雄花开放时鉴别可育 株和不育株并挂牌编号，选取不育株和可 育株各10 株，摘取全部雄花蕾及开放当天 的雄花后按不育和可育混合。采集的样品 经液氮处理后立即置于-70 冰箱中保存备 用。1.2 试剂 Takara RNA PCR Kit（AMV） Ver 2.1， DNase，T4 RNA 连接酶，dNTPs、Taq DNA 聚合酶、DNA 分子量Marker 均购自 Takara 公司，其余试剂为国产分析纯。 1.3引物 表1、表2 中的3 条锚定引物和26 条随机引 物由上海博亚生物技术有限公司合成。1.4 西瓜G
5、17AB 系雄花蕾总RNA 的提取及纯 化采用Trizol 试剂提取西瓜雄花蕾的RNA， DNase(RNase-free，5 UL-1) 降解总 RNA基因组DNA。用2%琼脂糖凝胶电泳检 测RNA 的完整性，岛津UV-2201 型紫外分 光光度计定量纯化的RNA 浓度，并调整至1 gL-1。 1.5 反转录PCR（RTPCR）采用RNA PCR Kit （AMV） Ver. 2.1 (TaKaRa)进行反转录，反应体系及操作步 骤按照说明书要求进行。反转录结束后取1 LcDNA 进行常规PCR反应，反应体积20 L，反应程序为：94 2min ；94 30 s ，40 45 s，72 20
6、 min， 30 个循环； 72 延伸5 min。4 保存。PCR 扩增产 物在6变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离， 电泳后银染拍照。 1.6 差异cDNA 条带的克隆、测序及序 列分析将差异片段从PAGE 凝胶上挖出， 放入0.2 mL离心管中，加纯水30 L，96 或煮沸10 min ，取其中4 L 为模板，于25 L 扩增体 系重新扩增。利用DNA 凝胶回收试剂盒从琼 脂糖凝胶中回收扩增片段，与pMD18-T 载体 连接，然后转化大肠杆菌JM109 感受态细胞 。通过蓝白斑筛选和PCR 鉴定阳性克隆，测 序工作由上海生工生物工程技术服务有限公 司完成。序列进入NCBI 数据库进行BLAST
7、分析。2.结果与分析 采用Trizol 试剂成功地从西瓜G17AB 雄性不育两 用系雄花蕾中分离出总RNA，2.0%琼脂糖凝胶电 泳检测结果表明，28S、18S 和5S RNA 谱带清 晰完整（图1-A），但含有基因组DNA。经DNA 酶消化，28S、18S 和5S 的RNA 条带清晰，基 因组DNA 谱带消失（图1-B）；紫外分光光度计 检测D260nm/D280nm 比值介于1.82.0，D 260nm/D 230nm 的比值均大于2.0 （表3）。表 明，利用Trizol 试剂提取西瓜G17AB 雄性不育两 用系雄花蕾总RNA 经DNA 酶消化后符合RTPCR 的分析要求。2.1 西瓜G
8、17AB 雄性不育两用系雄 花蕾总RNA的提取 本试验选用了AAGCT10G、AAGCT10A、 AAGCT10C 3 条锚定引物与26 条随机引物 组合成78 对引物组合， 对可育株与不育株 雄花蕾的cDNA 进行差异显示分析。结果显 示，所有引物组合均能扩增出条带，但不 同引物组合扩增的cDNA 条带数目不等， 多者可达50 余条，少的仅10 多条，一般在 30 条左右。2.2 不育株和可育株雄花蕾RT-PCR 的结果大多数引物组合的不育株与可育株雄 花蕾RT-PCR扩增谱带完全一致， 只 有少数引物组合显示谱带的差异（图2 ）。这表明混合取样可消除因不育和 可育雄花蕾发育时期的不同而造成
9、的 影响， 使谱带之间的差异表现为育性 差异。在78 对引物组合中，不育株雄花蕾与可育 株雄花蕾的DDRT-PCR 扩增产物完全相同的 为73 对组合，表现差异的组合共5 对，其中3 对是可育较不育多一条特异条带，2 对是不育 较可育多一条特异条带。经重复验证，仅有2 对引物组合的差异性条带表现稳定可重复，命 名为C13F 和G10S（图3）。C13F表示dC 锚 定引物和编号13 的随机引物组合，差异条带 出现在可育雄花蕾上；G10S 表示dG 锚定引 物和编号10 的随机引物组合，差异条带出现 在不育雄花蕾上。2.3 差异cDNA片断的克隆测序及序列分 析差异cDNA 片断从变性聚丙烯酰胺
10、凝胶上回 收后，重新经PCR 扩增，2琼脂糖凝胶电 泳。从琼脂糖凝胶上回收cDNA 片断，纯化 后直接与pMD 18TVector（TaKaRa）连 接，转化感受态Ecoil JM109。经蓝白斑筛 选，挑取白斑单菌落培养，煮沸法回收质 粒，PCR 鉴定后测序。2 个差异片断的序 列见图4。；对获得的cDNA 片断序列经国际互联网 GeneBank BLAST 序列分析，C13F 片断 与拟南芥-葡萄糖苷酶酶蛋白的编码序列具 有80同源性；G10S 片断与菜豆泛素 mRNA 部分编码序列具有92同源性。3.讨论mRNA 差异显示技术是一种快速高效的研 究基因差异性表达的方法，已在生物技术相关
11、领域中广泛应用。mRNA 差异显示技术具有假 阳性高的缺陷，要求研究的 2 个材料除要显示 差异外必须具备相同遗传背景，这样才能保证 所到的结果具有分析价值。本研究所选用的西 瓜细胞核雄性不育材料由自然突变造成，属等 位基因突变，且经过多代系内自交，不育株和 可育株除育性基因外具有相同的遗传背景。考虑到可育株与不育个体之间的遗传组成 可能存在一定的差异，且相同大小的雄花 蕾在发育时期上可能存在着不一致，本试 验采用混合取样法。试验结果表明：采用 混合取样法，大多数引物组合的不育与可 育雄花蕾的差异显示电泳图谱完全一致， 基本上消除了由于遗传景和发育时期不同 造成的过多假阳性条带的出现。 有关特
12、异 cDNA 片断与雄性不育关系的研究已 有一些报道7-10，并克隆了一些与雄性不育 相关的cDNA 片段。本研究克隆了 2 个与雄性 不育发生相关的 cDNA 差异片断，其中一个是 在可育雄花蕾中表达而在不育雄花蕾中不表达 的 cDNA 片断，该片断与 -葡萄糖苷酶酶蛋 白的部分编码序列具 80的同源性。-葡萄 糖苷酶（EC3，2，1，21），属于水解酶，其 功能是将纤维素二糖纤维素寡糖水解成葡萄糖 11。 由此可以推测，不育雄花蕾中 -葡萄糖苷 酶酶蛋白不表达，可能导致孢子发育过程 中营养物质不足，最终导致小孢子败育。 另一个仅在不育雄花蕾中特异表达的 cDNA 片断与菜豆泛素 mRNA的
13、部分编码序列具 有 92同源性，泛素的主要功能是参与细 胞内短周期寿命的蛋白质降解12。可以推 测不育雄花蕾中泛素基因的表达，可能造 成蛋白质降解而使细胞提前凋亡，最终导 致雄性不育。 目前分离所得的与雄性不育相关的基因还 不多，材料主要集中在拟南芥突变体上。 mRNA 差异显示技术分析西瓜 G17AB 两 用系雄花蕾基因的差异表达结果显示，不 育雄花蕾可育雄花蕾都具有特异的 cDNA 条带，表明不育雄花蕾和可育雄花蕾都产 生不同的 mRNA。由此可以推测，育性基 因可能为调节基因类型，其表达与否能调 控着某些基因的表达。 于远等10应用 mRNA 差异显示技术，研 究西瓜核雄性不育材料 Se
14、18 不育株和可育 株雄花花蕾中基因表达的差异，获得了 3个 与不育相关的特异cDNA 片段。本研究与此 研究结果的不同可能是由于试验材料、取 样方法和选的引物组合不同而造成的。由 于 mRNA 差异显示技术存在假阳性高的缺 陷，这些片段的可靠性还有于进一步 Northern 验证，其结构和功能均有待于进 一步深入研究。 本研究结果表明利用 Tizol 试剂可提取得到 高质量的西瓜雄花蕾中的总 RNA。采用 mRNA 差异显示技术分析西瓜 G17AB 雄 性不育两用系的不育株与可育株雄花蕾发 育过程中的基因表达差异，获得了 2 个稳 定的 cDNA 差异片段： C13F 和 G10S。 经克隆测序和同源性分析，C13F 片段与拟 南芥 -葡萄糖苷酶酶蛋白的部分编码序列 具有 80同源性；G10S 片断与菜豆的泛 素 mRNA 的编码序列具有92同源性。4.结论
