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1、APOPTOSIS细胞de凋亡 细胞凋亡概念 ( Apoptosis overview) 细胞凋亡的特征(Apoptosis Speciality) 细胞凋亡的检测方法(Detection methods for apoptosis) 细胞凋亡研究发展远景(A bright Future)一.细胞凋亡的概念 ( Apoptosis idea)细胞死亡分为正常死亡和非正常死亡非正常死亡:主要指由超细胞承受环境因素 引起的死亡. 正常死亡:自然衰老导致的死亡神经内分泌调节导致的死亡细胞程序性死亡(PCD)PCD:是指健康细胞发生的、由基因 决定的死亡过程也称细胞凋亡 。1.细胞凋亡是一个主动的、由
2、基因决定 的自杀过程!2. 细胞凋亡是维持机体环境稳定的重要 因素!3. 细胞凋亡对免疫系统具有重要意义!1987199119931996-7198919721977- 1982命名为凋亡定义死亡基因Bcl-2的发现发现p53凋亡的控制者Caspases被发现死亡受体 (TNFR,Fas/Apol-1) 细胞色素c的作用和凋亡 体的形成2000IAPs被发现Smac被发现1887染色质1965程序性细胞死亡ApoptosisApoptosisCancerwith p53 mutations(突变) hormone-dependent tumors Breast(乳腺) cancer Prost
3、ate(前列腺) cancer Ovarian(卵巢) cancer Autoimmune disorders SLE Glomerulonephritis(血管球肾炎) Viral infections AIDS Neurodegenerative disorders Alzheimers disease(老年痴呆) Parkinsons disease Cerebellar degeneration(小脑失调) Ischemic(缺血) injury Myocardial infarction(心肌梗死) Stroke(中风) Reperfusion(再灌注) injury Toxin-i
4、nduced liver disease Alcohol Drug二.细胞凋亡的特征1. 细胞膜皱缩、完整、表面有泡状2.核致密化、紧缩呈月牙状3.胞质浓缩、细胞器紧聚4.形成膜包的凋亡小体,细胞骨架解体(一). 形态学的变化NormalApoptotic正常细胞表面的微绒毛消失,细胞间的连接消失,细胞膜虽然完整,但是膜上新 出现了一些生物大分子,如磷脂酰丝氨酸.Cells dying by apoptosis. The electron micrograph shows an apoptotic cell in the mammary gland. (二). 细胞凋亡的 生化特征DNA片段化
5、后形成梯状条带“脚手架”核体DNA片段化后形成梯状条带多种酶活性的改变一)半胱天冬蛋白酶类(切冬酶)1993年Yuan从哺乳类细胞中发现第一个Ced-3同源分 子,取名叫白细胞介素1转换酶(ICE),是一种蛋白水 解酶,1994-1996年又发现10多个Ced-3同源分子,与细 胞凋亡作用相关.为方便起见,1996年国际会议统一定名 为Caspase (cysteine containing specific protease)并以发现的先后用阿拉伯数字顺序排名。与 细胞凋亡相关的有14个(与人类相关的有11个)起始物效应物胞质成熟Important Substrates of Caspase
6、s结构/运输 proteinsActin Fodrin Gelsolin Nuclear lamins A, B, C调节/信号 proteinsPro-caspases Bcl-xL Bcl-2 BID转录因子/调控因子MDM2 RB Sp1 IkB-a DNA/RNA 损伤和修复PARP DFF-45/ICAD DNA-PKCSMEKK-1 PKC and PAK2/hPAK65 p21WAF1/CIP1 FAK二)细胞色素C(Cyt C)位于膜间腔的Cyt C由于线粒体的损 伤而被释放入胞浆,使胞浆内此酶含量 增高,通过测定其活性可以辨别细胞是 否凋亡。Cyt C一旦进入胞浆,可结合凋
7、亡激活因子1,诱导其寡聚化,再聚 集Pro-Caspase-9形成凋亡复合体最 后导致细胞凋亡。 胞浆内Ca2+水平升高;一是胞内钙库释放 ,二是胞外钙内流,由于钙的持续升高, 作为启动凋亡的信号,而触发凋亡。 胞浆内PH的升高,也是触发凋亡的起始信 号。(三)其他生化特征改变三.细胞凋亡检测方法 (Detection methods for apoptosis)Mitochondrial events: Cyt.c releasing Mem.event磷脂酰丝酰丝 氨酸 外翻 Nuclear event DNA fragmentationCaspases cascade Other apo
8、ptosis eventsps细胞凋亡的测定(一)形态学检测 形态学检测是鉴定细胞凋亡最可靠的方法 之一。主要通过对组织或细胞进行各种染 色,如HE染色,甲基绿派诺宁染色, Giemsa染色,在光学显微镜下观察;用荧 光染料如吖啶橙,Heochst33258染色,在 荧光显微镜下观察;或制成超薄切片用电 子显微镜观察,可以区分细胞凋亡与坏死 。NormalApoptotic正常细胞表面的微绒毛消失,细胞间的连接消失,细胞膜虽然完整,但是膜上新 出现了一些生物大分子,如磷脂酰丝氨酸.Cells dying by apoptosis. The electron micrograph shows a
9、n apoptotic cell in the mammary gland. (二)生化特征检测细胞凋亡最显著的生化特征是:依赖于 Ca2+、Mg2+的内源性核酸酶被激活后,将 细胞核染色体从核小体间断裂,形成长短 不一的核酸片段后,再用琼脂糖凝胶电泳 便可以检测到DNA梯形带,此法具有很高 的特异性和敏感性,为凋亡的研究提供了 强有力的工具和手段。DNA ladder assayed with the Apoptotic DNA Ladder Kit Lane Identification: M = Size marker = Control cells without camptothec
10、in(喜树硷) + = Cells treated with camptothecin C = Positive control from the kitAnnexin V(磷脂结合蛋白)-FITC, EGFP, Cy3,PE, Cy5, PE-Cy5, Biotin PI(三)流式细胞仪检测法此法有其他方法不可比拟的优越性,他既 可以定性又可以定量,而且具有简单、快速和 敏感等优点,通过流式细胞仪将细胞分类后还 可以作进一步的形态学和生化特征性分析。其检测原理是根据凋亡引发的在细胞结构、 亚细胞结构和分子水平上所发生的特征性改变 ,造成染色体荧光染料对凋亡细胞DNA的可染 性发生改变,以及细
11、胞形态的改变影响了光散 射特性。流式细胞 仪原理散点图流式细胞仪 测定细胞凋 亡的散点图 TNF (100、 300、500 IU/ml)诱导 L929 细胞 14h, Annexin V-FITC/PI 标 记细胞2003.7.25流式细胞仪测定细 胞凋亡的散点图 TNF (100、300、 500 IU/ml)诱导 L929 细胞14h, Annexin V-FITC/PI 标记细胞2003.7.29流式细胞仪测定细 胞凋亡的直方图TNF (100、300 、500 IU/ml)诱 导L929 细胞14h, FITC-DEVD- FMK 标记细胞 2003.7.29流式细胞仪测定 细胞凋亡
12、直方图 TNF (100、300、500 IU/ml )诱导L929 细胞14h, Annexin V-FITC/PI 标记细 胞 2003.8.1四、细胞凋亡研究发展远景一.细胞凋亡发生机制Two Apoptosis Signaling PathwaysBy cell death receptorsBy mitochondria 配体 受体Death receptor (死亡受体)Adapter (结合体)Caspases(起始)Caspases(效应)Regulators apoptosis (凋亡)Human Death Ligands (死亡配体) ? Fas-L(自杀相关因子), T
13、NF, TRAIL ? Fas , TNFR1, TRAIL-R ,DR? FADD, TRADD, RIP, RAIDDCED-4 Caspases 2, 8,9,10 , Apaf-1(凋 亡激活因子 )CED-9 Bcl-2, Bcl-xL, Bad Bax BakBid, IAPs,Smac,HtrA2,FLIPsCED-3 Caspases 3, 6, 7, AIF,Endo-GCell Death Receptors and Ligands受体 配体 结果TNFR1TNFa ApotosisTNFR2TNFa Anti-apoptosisFas/CD95/Apo1 FasL Apo
14、tosis DR3/Apo3/Wsl-1Apo3L Apotosis/Anti-apoptosisDR4Apo2L/TRAIL Apotosis DR5/Apo2/TRAIL-R2 Apo2L/TRAIL ApotosisTRAIL - TNF-related apoptosis-inducing ligandCaspase抑制剂1. Viral inhibitors CrmA: Caspase-1, 8 p35:Caspase-1, 3, 6, 7, 8, 102. Cellular inhibitors XIAP:Caspase-3, 7, 9 cIAP1:Caspase-9 cIAP2:
15、Caspase-3, 7, 9 Survivin:Caspase-3, 7 Bcl-2:Caspase-3, 7, 8, 93. Synthetic inhibitors General inhibitors 可逆 inhibitors Specific inhibitors 不可逆 inhibitors简介:系统性红斑狼疮-FAS表达缺陷病毒感染引起的肿瘤转化:人乳头瘤病毒分泌E6,促进P53分解杆状病毒的P35直接激活CAS-3.一般肿瘤都有高表达FasL现象,以凋亡淋巴细胞,而又低表达F as.简介:心血管疾病:细胞凋亡过度引起传导障碍神经系统疾病:细胞凋亡过度AIDS病:T细胞凋亡,棉衣系统崩溃Lyell综合征:是一毒性种表皮死亡分解病,死亡率很高,是因为血液中出现高水平的sFasL.肝衰竭疾病:胆汁淤积:高水平的甘氨胆酸直接激活FAS,直接损伤线粒体重症肝炎:T细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞,而表达FasL,引起大面积细胞凋亡.感谢大家光临Thank you !