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1、第三章DNADNA的提取与纯化的提取与纯化基因工程需要三种不同的DNA:总DNA质粒DNA 噬菌体DNA学习内容：l制备细胞总DNA 培养、搜集细菌细胞 制备细胞提取物 DNA纯化、浓缩 从其他生物中提取总DNA l质粒DNA提取 根据分子大小分离 根据结构分离 质粒扩增 l提取噬菌体DNA 噬菌体的培养 制备非溶源性噬菌体 收集噬菌体 从噬菌体中纯化DNA 纯化M13 DNA Figure3.1 The basic steps in preparation of total cell DNA from a culture of bacteriaBasic Steps1.制备总DNA基本步骤：
2、 1) 收集细菌细胞 2)打碎细胞，释放内容物 3)去掉DNA以外的成分 4)DNA溶液的浓缩1.1培养、搜集细菌细胞两种类型的细菌培养基的成分：lM9培养基：Na2HPO4(6.0) KH2PO4(3.0) NaCl(0.5) NH4Cl(1.0) MgSO4(0.5) Glucose(2.0) CaCl2(0.015)lLB培养基： Yeast extract(5) NaCl(10)1.1培养、收集细菌细胞37C，150- 250rpm达到最 大浓度2- 3109cell/ml, 600nm下的OD 值，1OD相当于 0.8109cell/ml Figure3.2 Estimation o
3、f bacterial cell number by measurement of optical densityFigure3.3 Harvesting bacteria by centrifugation1.2 制备细胞提取物l利用溶菌酶、EDTA或两者结合。溶菌酶是存在于蛋清或眼泪、唾液等分 泌物中，消化多聚物。 EDTA络合保持细胞结构完整的镁离子 ，也可以抑制细胞中降解DNA酶的活性 。 一般溶菌酶或EDTA足以破坏细菌细胞 ，在提取液中同时还加入SDS。Figure3.4 Preparation of a cell extract.Preparation of a cell ext
4、ractPreparation of a cell extractFigure3.5 Removal of protein contaminants by phenol extraction. Purification of DNA from a cell extractPurification of DNA from a cell extract1.制备细胞总DNA1.4 DNA的浓缩与浓度测定l最常用的方法是乙醇沉淀（同时含有Na离 子）。DNA沉淀可用玻璃棒挑出，或者离 心沉淀。l260nm下测定吸光度，1OD相当于50g双 链DNA/ml。A260/A280=1.8，2说明有RNAFi
5、gure3.6 Collecting DNA by ethanol precipitation . Concentration of DNA samples Concentration of DNA samples Figure3.7 The CTAB method for purification of plant DNA Plant DNA(CTABPlant DNA(CTAB法法) )十六烷基三 甲基溴化铵Figure3.8 The use of an anion-exchange chromatography resin in DNA purification.阴离子交换层析法阴离子交
6、换层析法2 质粒DNA提取l质粒DNA的大小（ 8%）。lDNA的构造 Alkaline denaturation Ethidium bromide（溴化二氨乙苯啡 啶）-caesium chloride（氯化铯） density gradient centrifugation2质粒DNA提取2.1 根据分子大小提取质粒DNAlsphaeroplasts裂解细胞可以破坏部分细胞 壁，而保持细胞膜的完整。 l问题： 裂解液中不可避免的包含一些染色体 DNA 质粒分子非常大时 ，将与染色体DNA 共沉淀Figure3.9 Preparation of a cleared lysatelysate.
7、Sphaeroplast残壁细胞2质粒DNA提取2.2 根据分子构造提取l碱裂解法基本原理：在非常窄的pH范围内，非螺旋化 的DNA会变性，而螺旋化的质粒不变性。在 裂解液中加入氢氧化钠，调pH值至 12.012.5,破坏氢键，使DNA变性。加入酸 ，变性的细菌DNA进一步聚集形成沉淀，通 过离心的方法去除。另外一个优点，利用 SDS（十二烷基磺酸钠）（Sodium dodecyl sulfate，SDS），裂解，KAc中和可以去掉大 部分的蛋白质和RNA。Figure3.10 Two conformation of circular double-stranded DNA.Two confo
8、rmation of circular double-stranded DNATwo conformation of circular double-stranded DNAFigure3.11 Plasmid purification by the alkaline denaturation method.Alkaline denaturation2质粒DNA提取2.2 EBCsCl密度梯度离心法l在大离心力条件下，形成梯度，生物 大分子形成条带。条带的位置取决于 其浮力密度。最上部是蛋白质，中间 是DNA，下部是RNA。Figure3.12CsCl density gradient cen
9、trifugation.CsCl density gradient centrifugation2.2 EBCsCl密度梯度离心法lEB插入相邻的碱基之间，降低了DNA的 浮力密度，但超螺旋的DNA结合EB浮力 密度降低较小，仅有0.085g/cm3。lCsCl可以用丁醇抽提，透析除去。纯度可 达100%。Figure3.13Partial unwinding of the DNA double helix by EtBr intercalation between adjacent base parirs.EBEBEB如何与DNA结合?Figure3.14Purification of pl
10、asmiod DNA by EtBr-CsCl density gradient centrifugation如何分离质粒 DNA？2质粒DNA提取2.3 质粒扩增一些多拷贝质粒具有在无蛋白合成条 件下复制的能力。当细胞增加到足够 数目时，加入蛋白合成抑制剂如氯霉 素，继续培养。在这个过程中，质粒 分子继续复制，但染色体的复制和细 胞分裂已经停止，可以获得上千个拷 贝。Figure3.15 Plasmid amplification Plasmid amplificationInhibitor of protein synthesis: Chloramphenical, 12h, 3 噬菌体D
11、NA的制备当培养物离心时，细菌沉淀到底 部，噬菌体留在悬浮液中，去蛋 白就可以获得噬菌体DNA。 然而获得大量的噬菌体DNA是 一个障碍。每ml菌液可以获得 1010噬菌体，但只能产生 500ngDNA。3 噬菌体DNA的制备3.1 噬菌体的培养自然培养的噬菌体是溶源性的 。要获得大量的细胞外噬菌体 ，必须经过诱导培养使所有的 噬菌体都进入裂解周期，使细 胞死亡释放噬菌体。3.1 噬菌体的培养l大部分实验室都使用cI突变的温度敏 感突变体。cI基因可以使噬菌体保持 整合状态，突变后转变成溶菌性的。 在cIts突变体中，cI基因在30C条件 下正常表达，在42C时，不能正常表 达，产生溶菌性。F
12、igure3.17 Induction of a clts lysogen（溶原菌） by transferring from 30 to 42LysogenicLysogenic phage phageAt 30 At 30 , , cltsclts gene gene protein works, Keep protein works, Keep lysogenylysogeny（溶原性）（溶原性）: :At 42 At 42 , , cltsclts gene gene protein does not protein does not work, produce work, produ
13、ce extracellularextracellular phagephage（ 细胞外抗菌素）细胞外抗菌素）. .Figure3.18 Achieving the right balance between culture age and inoculum size when preparing a sample of a non-lysogenic phageNon-Non-lysogeniclysogenic phage phage（LyticLytic) )由于缺失修饰，大 多数基因工程载体 属于此类型。3 噬菌体DNA的制备3.3 收集噬菌体噬菌体颗粒非常小，所以 只有高速离心才能
14、沉淀。通常利 用PEG沉淀病毒颗粒，形成多聚 体。离心可以收集噬菌体，重新 溶解在少量的溶液中。3 噬菌体DNA的制备3.4 从噬菌体中纯化DNA PEG沉淀物中可能含有少量的细菌裂 解物，也可能含有细菌DNA。这些组 成部分可以通过梯度离心去掉。除去 CsCl后可以获得纯净的噬菌体。然 后通过酚抽提或者蛋白酶处理蛋白质 外壳。Figure3.19 Collection of phage particles by polyethylene（聚 乙烯） glycol（乙二醇）(PEG) precipitation Collection of phage particlesCollection o
15、f phage particlesPurification Purification of phageof phageFigure3.20 Purification of phage particles by CsCl density gradient centrifugation.3.5 纯化M13 DNA l每ml菌液可以获得1012的噬菌体。这 意味着少量的培养物可以获得大量的 噬菌体，如5ml或更少。l由于细菌细胞不裂解，没有细胞裂解 物的问题，也不需要CsCl梯度离心。Figure3.21 Preparation of M13 DNA from an infected culture of bacteria.PreparationPreparationof M13 DNAof M13 DNANext chapNext Chap中国基因工程研究进展*The end！Thanks！测验一l根据你的理解，回答以下三个问题。 1、什么是基因工程技术？基因工程的意义 何在？ 2、简要说明基因工程研究的基本步骤？ 3、谈谈你对基因工程技术未来的发展趋势 及构想。
