实验六实验六 细胞组分的分离与鉴定细胞组分的分离与鉴定 一、实验目的Ø 了解用细胞匀浆和差速离心的方法分级分离细胞组分的原理及过程 Ø 熟悉离心机、匀浆器的使用方法 二、实验内容㈠实验原理细胞内各种结构的比重和大小都不相同，在细胞内各种结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同介质和不同转速的离心法，将细胞理，常用不同介质和不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来内各种组分分级分离出来此法是通过组织细胞匀浆、分级分离（密度此法是通过组织细胞匀浆、分级分离（密度梯度离心或差速离心）和分析三个步骤完成的梯度离心或差速离心）和分析三个步骤完成的 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心， 用于分离不同大小的细胞和细胞器用于分离不同大小的细胞和细胞器在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、 线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基 体、最后为核蛋白体。
体、最后为核蛋白体速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀 1.差速离心（differential centrifugation）用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的 密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部， 通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离常通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离常 用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖2.密度梯度离心(density gradient centrifugation)㈡㈡实验方法实验方法1. 1. 处死家兔处死家兔：耳缘静脉空气栓塞法：耳缘静脉空气栓塞法2. 2. 制备肝细胞匀浆制备肝细胞匀浆: : n n家兔处死后，立即剖腹取肝，迅速浸入预家兔处死后，立即剖腹取肝，迅速浸入预 冷的冷的生理盐水中洗去血污，用滤纸吸干生理盐水中洗去血污，用滤纸吸干 n n按每克肝重加按每克肝重加9ml9ml冷的冷的0.25mol/L0.25mol/L蔗糖溶液蔗糖溶液 匀浆匀浆化20g×9ml/g=180ml20g×9ml/g=180ml））n n用八层纱布（先用少量蔗糖液湿润），过用八层纱布（先用少量蔗糖液湿润），过 滤匀滤匀浆液于烧杯中。
浆液于烧杯中制备一张滤液涂片制备一张滤液涂片，做好，做好 标标记，自然干燥记，自然干燥每组取每组取10ml10ml滤液，滤液，3000r/min3000r/min离心离心10min10min，，制备制备 一张上清液涂片一张上清液涂片，做好标记，自然干燥做好标记，自然干燥 吸去上清，用吸去上清，用10ml 0.25 mol/L 10ml 0.25 mol/L 蔗糖液悬浮沉蔗糖液悬浮沉 淀物，用吸管混匀，配平后以淀物，用吸管混匀，配平后以3000r/min3000r/min离心离心10 10 minmin吸去上清液，加入吸去上清液，加入0.5ml0.5ml蔗糖溶液，用吸管吹蔗糖溶液，用吸管吹 打成悬液，打成悬液，制备一张涂片制备一张涂片，做好标记，自然干燥做好标记，自然干燥 3.3.差速离心法分离细胞器差速离心法分离细胞器 n n低速离心分离细胞核低速离心分离细胞核n n高速离心分离线粒体高速离心分离线粒体4. 4. 分析分析将干燥后的三张涂片浸入将干燥后的三张涂片浸入95%95%乙醇乙醇5 min5 min，，晾晾干在涂膜部分滴加数滴干在涂膜部分滴加数滴甲基绿甲基绿- -派洛宁染液染色派洛宁染液染色20 min20 min，，再以再以纯丙酮分化纯丙酮分化20s20s，，蒸馏水漂洗，直立蒸馏水漂洗，直立于吸水纸上吸干水分。
于吸水纸上吸干水分在高倍显微镜下比较观察三张涂片在高倍显微镜下比较观察三张涂片细胞核细胞核被染成蓝绿色，核仁和细胞碎片染成淡红色被染成蓝绿色，核仁和细胞碎片染成淡红色。