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1、 实验五动物肝脏DNA的提取和鉴定(教材110页)一原理 DNA 、 RNA在细胞内多以核蛋白 体形式存在-DNP 、 RNP分离提取核酸时首先要破碎细胞去 除蛋白质和其他物资, 用0.14mol/L Nacl(含柠檬酸钠)匀浆液溶解细胞中的 RNA及其他物资,离心，去上清,然后加 入提取液（十二烷基硫酸钠，SDS）溶 液溶解DNA，然后加入氯仿-辛醇，以去 除其余核蛋白和杂蛋白再离心除去沉 淀(杂蛋白)部分,收集上清部分(DNA).最后加入的冷乙醇使DNA析 出 1 1、核酸的理化性质、核酸的理化性质 RNARNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结 晶，晶，DNAD
2、NA则为白色类似石棉样的纤维状物则为白色类似石棉样的纤维状物 。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和 核苷酸大都呈酸味。核苷酸大都呈酸味。 DNADNA、RNARNA和核苷酸都是极性化合物，和核苷酸都是极性化合物， 一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机 溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水， RNARNA钠盐在水中溶解度可达钠盐在水中溶解度可达40g/L40g/L。DNADNA 在水中为在水中为10g/L10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸，呈黏性胶体溶液。在酸 性溶液中，性溶液中，DNADNA、R
3、NARNA易水解，在中性或易水解，在中性或 弱碱性溶液中较稳定。弱碱性溶液中较稳定。 天然状态的天然状态的DNA DNA 是以脱氧核糖核蛋白是以脱氧核糖核蛋白(DNP)(DNP)形式存形式存 在于细胞核中。要从细胞中提取在于细胞核中。要从细胞中提取DNA DNA 时，先把时，先把DNPDNP 抽提出来，再把抽提出来，再把P P除去，再除去细胞中的糖，除去，再除去细胞中的糖，RNA RNA 及无机离子等，从中分离及无机离子等，从中分离DNA DNA 。 DNPDNP和和RNPRNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而 不同。不同。DNPDNP在低浓度盐溶液中，几乎
4、不溶解，如在在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在 0.14 mol/L0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度 的的1%1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L1mol/L 氯化钠中的溶解度很大，比纯水高氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2 2倍。倍。 RNPRNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在 0.14mol/L0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时， 常用此法分离这两种核蛋白。常用此法分离这两种核蛋白。
5、将提取得到的DNA放在滤纸上,将液体吸 干,将其置于试管内,加入3毫升硫酸进行酸水 解，进而分三份，分别对其脱氧核糖、嘌呤 碱、及磷酸进行 鉴定。1、脱氧核糖的鉴定脱氧核糖在酸性溶液中加热(水浴箱加 热)能与二苯胺作用生成蓝色化合物2、嘌呤碱的鉴定嘌呤碱与AgNO3在碱性环境中作用可 产生褐色的嘌呤银化合物。3、磷酸的鉴定在酸性条件下，磷酸与钼酸铵作用可产生黄 色磷钼酸铵沉淀，磷钼酸铵在抗坏血酸、氯化亚 锡等物存在下可被还原成钼兰（蓝色）。二器材与试剂1、器材 （1）培养皿 （2）手术剪刀 （3）电动组织捣碎机（4) 离心机(5) 普通光学显微镜(6) 冰箱(7) 具塞离心管(8) 弯头滴管(
6、9)小 烧杯(10) 紫外分光光度计(11)分析天平(12)恒温水浴(13)硬质玻璃试管(14)新鲜猪肝脏(15)冰块2. 试剂（1）匀浆液（ 0.1 mol/L NaCl 0.05 mol/L 柠檬酸钠混合盐） （2） 提取液（ SDS 2mMOL/L溶液） （3）氯仿：辛醇溶液（4）无水乙醇（置冰箱中冷却）（5）H2SO4溶液（6）二苯胺溶液溶液（7）NAOH溶液（8）AgNO3溶液(9)钼酸胺溶液 （10）Vc-氯化亚锡溶液三操作步骤取鸡肝2.5克，用剪刀剪碎，置乳钵 （或匀浆器）中研磨5分钟，加匀浆液 5ml，进一步研碎，倾入离心管离心（ 3500r.p.m 10 ),弃上清（RNP部
7、分 ），加入提取液2.5ml，混合均匀，振摇 8分钟，加入4.0ml氯仿-辛醇溶液，继续 振摇8分钟，离心（3500r.p.m 15),吸出上清（约3ml)于一小烧杯，加入 二倍体积的95%冷乙醇溶液（边加边用 玻棒轻搅）缠出DNA纤维，将其置于滤 纸上吸干多余的液体。将DNA置于试管 中加入3.0ml硫酸溶液，水浴箱加热15 分钟，促其溶解，以备鉴定。 鉴定: 脱氧核糖的鉴定 1.O ml DNA溶解液+二苯胺 加热10分钟 生成蓝色 化合物. 嘌呤碱的鉴定 1.0ml DNA溶解液 + 1.0ml NAOH+1.0mlAgNO3-产 生褐色的嘌呤银化合物。 磷酸的鉴定 1.0ml DNA溶
8、解液 +2,0ml溶液钼酸铵溶液-产生黄色磷 钼酸铵沉淀，磷钼酸铵在抗坏血酸、氯化亚锡等物存在下可被 还原成钼兰（蓝色）。四现象及解释；五结果与讨论：六注意事项每步操作中都注意将离心管内容物充分混匀 ，以保证提取效果冷乙醇的作用是使DNA充分析出，乙醇须置 于零上C充分冷却离心过程中要特别注意离心机使用方法，注 意事项如下：（）位置对应的离心管离心前必须在普通天平上平衡。（）离心时，离心机的机盖必须盖严，由低到高慢慢调 速（）停止离心时，须先行关闭电源，待离心机确实停止 转动， 方可打开离心机的机盖三操作步骤三操作步骤1. 1. 取冷冻鸡肝取冷冻鸡肝2.52.5克，迅速置研钵中研磨克，迅速置研
9、钵中研磨5min5min； 2. 2. 加匀浆液加匀浆液5ml5ml，进一步研碎，倾入离心管离心，进一步研碎，倾入离心管离心 （3000r.p.m 3000r.p.m 10min),10min),弃上清（弃上清（RNPRNP部分部分) )； 3. 3. 加入提取液加入提取液2.5ml2.5ml，混合均匀，振摇，混合均匀，振摇8min;8min; 4. 4. 加入加入4.0ml4.0ml氯仿氯仿- -辛醇溶液，振摇辛醇溶液，振摇8min8min，离心，离心 （3000r.p.m 3000r.p.m 15min);15min); 5. 5. 吸出上清（约吸出上清（约3ml)3ml)于一小烧杯，加入二倍体于一小烧杯，加入二倍体 积的积的95%95%冷乙醇溶液（边加边用玻棒轻搅）缠冷乙醇溶液（边加边用玻棒轻搅）缠 出出DNADNA纤维，将其置于滤纸上吸干多余的液体纤维，将其置于滤纸上吸干多余的液体; ; 6. 6. 将将DNADNA置于试管中加入置于试管中加入3.0ml3.0ml硫酸溶液，水浴硫酸溶液，水浴 箱加热箱加热15min15min，促其溶解，以备鉴定。，促其溶解，以备鉴定。
