BIOSEP蛋白质沉淀法

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1、蛋白沉淀法与饮食文化 1）、豆腐的由来：“来其”、“黎其”，汉朝淮南王 刘安2）、一人得道，鸡犬升天问题 问题： A、1941-12-7, 7:59am 珍珠港事件 - 烧伤 - 蛋白流失，感染 B、急性肾炎 - 蛋白流失人血清白蛋白第十二章蛋白质沉淀法1、概述 2、蛋白质溶解 3、蛋白质溶液的稳定因素 4、蛋白质沉淀方法分类 5、盐析法 6、|pH水 pI| Value调节法 7、有机溶剂沉淀法 8、亲水聚合物沉淀法 9、沉淀动力学 10、Applications 1 概述 定义 常用加入试剂的方法，改变溶剂和溶质的能量 平衡来降低其溶解度，使产物离开溶液生成不 溶性颗粒，沉降析出。沉淀具有

2、浓缩与分离的 双重作用。与结晶联系在本质上都是新相析出的过程，主要是物理变 化，当然也存在化学反应的沉淀或结晶。区别 结晶为同类分子或离子以有规则排列形式析出 ，沉淀为同类分子或离子以无规排列形式析出 。1 概述 优点 A、设备简单、成本低、放大容易，产物浓度越高沉淀越 有利，收率越高； B、原料液体积很快地减小1050倍，从而简化生产工艺、 降低生产费用； C、使中间产物保持在一个中性温和的环境； D、及早地将目标pro.从其pro.水解酶分离出来，避免pro降 解，提高产物稳定性； E、用沉淀法作为pro色谱分离前处理，可使使用色谱分离 的限制因素降低到最少。缺点： A、沉淀物可聚集有多种

3、物质，如大量盐类和溶剂，所以 沉淀法所产品纯度通常都比结晶法低； B、过滤较困难2 蛋白质溶解蛋白质溶解：相似者相溶 aa的亲水性和疏水性：有利因素：亲水性，包括氢键、 极性基团、离子化侧链、亲水 aa所占的%等。如白蛋白 不利因素：疏水性，包括暴露的 疏水基团、疏水aa所占的%等。 如纤维蛋白原。3 蛋白质溶液的稳定因素1)、水化层(hydration shell) tight hydration shell(0.35g water/1g pro) loose hydration shell(2g water /1g pro) 2)、静电排斥 zeta电势 Nernst Potential胶

4、核表面电位(不可 测) Stern Potential(不可测) Potential滑面电位(可测,mobility)电位Nernst电位 ionic strength3)、|pH水 pI| Value|pH水 pI| Value zeta电势水化层 静电排 斥Tight hydration shell Protein core Loose hydration shell4 蛋白质沉淀方法分类1）、盐析法2）、有机溶剂沉淀法3）、 |pH水 pI| Value调节法4）、亲水聚合物沉淀法5）、聚电解质絮凝法6）、高价金属离子沉淀法7）、亲和沉淀法5 盐析法机理：A、zeta potential

5、；B、hydration shell5 盐析法计算: Cohnx经验公式式中, S为蛋白质的溶解度(g/L) ；I为离子强度；m为盐的摩尔浓 度；值为蛋白质在纯水中(I=0 时)的假想溶解度对数值，是pH 值和温度的函数，在蛋白质pI时 最小；Ks为盐析常数，与温度和 pH值无关。5 盐析法方法: A、 “Ks”分级盐析法 ：在一定pH值及温 度下，改变盐浓度 （即I）达到沉淀的 目的。B、“”分级盐析法： 在一定I下，改变溶 液的pH值及温度达 到沉淀的目的。C、应用：一般的初 步分离用第一种方 法，进一步纯化时 用第二种方法。5 盐析法影响因素 A、无机盐种类 感胶离子序(Hofmeist

6、er序列): In 1888，Hofmeister对一 系列盐沉淀蛋白质的能力 进行了测定研究。 阴离子排序为：柠檬酸根3- 酒石酸根3- F- IO-3 H2PO-4 SO-4 CH3COO- Cl- ClO-3 Br- NO-3 ClO-4 I- CNS-; 对阳离子排序为： Th4+ Al3+ H+ Ba2+ Sr2+ Ca2+ Cs+ Rb+ NH4+ K+ Na+ Li+5 盐析法结论： a不同种类的盐主要影响Ks； b 离子半径小，带电多，电荷密度高，盐析效果好。无机盐的挑选原则：a 较高的盐析效能； b高溶解度，能配置高离子强度的盐溶液； c溶解度受温度的影响小； d盐溶液的密度

7、不高，便于蛋白质沉淀和离心分离； e不易引起蛋白质的变性； f价格低廉；最常用(NH4)2SO4。优点：符合上述要求；缺点：水解后溶液pH降低， 在高 pH下产氨，腐蚀性强，有异味，有毒，终产物必须除尽。 次常用Na2SO4。缺点：在400C以下溶解度较低，主要用于热稳定蛋白。5 盐析法B、无机盐添加方式5 盐析法C、温度T 主要考虑不能影响主要 产物的活力,即在其稳定 的温度下盐析,可通过实 验决定,一般来说,温度 越低,形成沉淀越不易, 但也有相反的情况.实际 上,盐析的温度范围较大 ,所有一般都在常温下盐 析.5 盐析法D、溶液pHpH影响Cohnx方程中的值 。见图图有何用？6 等电点

8、沉淀法 等电点沉淀法中的pH值作用 于值而隐含在Cohnx公式 中，pI值通常在pH46范围 内变化，一般用无机酸（ 如盐酸、磷酸和硫酸）作 沉淀剂。 在蛋白质疏水性比较大和结 合水比较小时这种类型的 沉淀更有效。为了提高等 电点法的沉淀能力，常将 其与盐析法、有机溶剂法 或其他沉淀法一起使用。 最大缺点：无机酸会引起较 大的蛋白质不可逆变性的 危险。7 有机溶剂沉淀法 同盐析一样，随着沉淀 剂有机溶机浓度的 上升，蛋白质溶解度也 呈指数规律下降。式中, So为当（K/e2） 0时S的外推值；e为水- 有机溶剂混合物的介电 常数；K为常数(水的介 电常数的吸收系数)。7 有机溶剂沉淀法 有机溶

9、剂的种类： 丙酮(首选)、乙醇、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀pro 。 机理： A、有机溶剂沉淀法的机理是加入溶剂后，会使水溶液的介电 常数降低，而使pro分子间的静电引力（库仑力）增大，导致 凝集和沉淀。 B、有机溶剂使pro溶剂化，使原来与pro结合的水被溶剂所取代 ，从而降低了pro溶解度。这种理论不能说明为什么乙醇比丙 酮的亲水性强，丙酮却比乙醇沉淀pro的能力强，也解释不了 丙酮、乙醇之类溶剂在所谓脱去pro水膜的过程中容易造成 pro变性，而盐析脱水时不造成pro变性。 C、丙酮、乙醇等不仅是pro的沉淀淀剂，而且还是一种变性剂 ，可见作用有机溶剂使pro在沉淀和变性之间既有区

10、别又相关 联。7 有机溶剂沉淀法 影响因素及控制 A、T：当乙醇与水混合时，会放出大量的稀释热，使溶 液T显著升高，对不耐热的pro影响较大。解决办法：搅 拌、少量多次加入，以避免温度骤然升高损失pro活力 。另一方面温度还会影响有机溶剂对pro的沉淀能力， 一般温度越低，沉淀越完全，所以在乙醇沉淀人血浆蛋 白时，温度控制在-10C下进行。 B、乙醇：通常随乙醇上升，pro溶解度下降。如血纤 维蛋白原的最大溶解度在乙醇浓度为8%时达到最大， 而当乙醇浓度为40%时达到最小。 C、pH值：在确定了乙醇以后，pro最低溶解度出现在蛋 白.的pI处，因此可以通过调节pH值来选择性分离蛋白 质。 D、

11、pro：避免使用很稀的浓度，因pro在高浓度下才较稳 定。7 有机溶剂沉淀法优点： A、某些蛋白质沉淀的浓度范围相当宽，所得产品的纯度 较高， B、从沉淀的蛋白质中除去有机溶剂很方便，而且有机溶 剂本身可部分地作为蛋白质的杀菌剂；缺点： A、耗用大量溶剂，而溶剂来源、贮存都比较困难麻烦； B、且沉淀操作需在低温下进行，使用上有一定的局限性 ； C、收率也比盐析法低； D、试剂易燃，有毒。8 非离子型聚合物沉淀法 某些聚合物，如聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（ PVP）和葡聚糖等，具有沉淀蛋白质的作用。其中最常 用的是PEG，相对分子质量从200D到20KD的不同聚合 程度的产品都是有效的，

12、通常在蛋白质沉淀中使用PEG -6000或PEG-4000。计算公式： 式中，S-溶解度；c-PEG浓度；-常数，受溶液条件的 影响(如pH值和离子强度)；K-常数，由pro大小和PEG 的类型决定。 适应条件：上式适用性广，但在低浓度蛋白质，如1.5g/L 和高浓度蛋白质，如75g/L和150g/L时，实验结果会偏 离线性。这时方程需校正8. 非离子型聚合物沉淀法 8. 非离子型聚合物沉淀法优点： A、体系的温度只需控制在室温条件下； B、沉淀的颗粒往往比较大，产物比较容易收集； C、PEG非但不会使pro变性,而且可以提高它的稳定性； D、PEG无毒，优先使用在临床产品的加工过程中被。缺点

13、： A、PEG比其他沉淀剂更难从蛋白质溶液中除去为此需用 超滤和液-液萃取来解决； B、价格较昂贵。9. 沉淀动力学 溶解度是一个平衡特性，但是溶解度值的降低是一个动力 学过程。当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生 聚集作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起： A、热运动（Brownian运动）； B、对流运动，由机械搅拌产生； C、差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。 第A、B两种机理在蛋白质沉淀中起主导作用，第种机 理在沉降过程中起主导作用(如在废水处理中)。 异向聚集：由Brownian运动所造成的碰撞导致。同向聚集：而由对流运动所造成的碰撞导致。9. 沉淀动力学 沉淀过程步骤

14、：A、初始混合，蛋白质溶液与沉淀剂在强烈搅拌下混合； B、晶核生成，新相形成，产生极小的初始固体微粒； C、扩散限制生长，晶核在Brownian扩散作用下生长，生 成亚微米大小的核，这一步速度很快； D、流动引起的生长，这些核通过对流传递（搅拌）引起 的碰撞进一步生长，产生絮体或较大的聚集体，这一步 是在较低的速度下进行的。 E、絮体的破碎，破碎取决于它们的大小、密度和机械阻 力。 F、聚集体的陈化，在陈化过程中，絮体聚得大小和阻力 平衡。 10 Applications早在50年前，Edwin Cohnx及其合作者就是用乙醇来完成蛋白质沉淀 经典实验的。他们应用低温乙醇分级沉淀人血浆的办法制备了白 蛋白溶液，并通过冷冻干燥将乙醇从成品中去除，所得产品成功 地救治了1941年珍珠港空袭后的幸存者。除此以外，免疫球蛋白 、血纤维蛋白原等其他许多蛋白质都是利用上述方法进行沉淀的 。