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1、免疫学实验课件生化与免疫学实验室中性粒细胞的吞噬作用【实验目的】1.熟悉中性粒细胞吞噬 实验的原理和方法。2.通过本实验理解机体 的非特异性免疫机制。【实验原理】中性粒细胞具有吞噬杀 菌功能，当与颗粒性物质（如葡 萄球菌等）混合孵育一定时间后 ，颗粒性物质被吞噬杀灭，根据 吞噬率、吞噬指数可反映该细胞 的吞噬功能。【实验材料】1.表皮（白色）葡萄球菌菌液（ 浓度610亿/ml)。2.肝素溶液（25U/ml）；甲醇， 碱性美蓝（或瑞氏）染液。3.血红蛋白吸管，凹玻片，载玻 片，采血针，微量加样器，湿盒，显微镜 ，恒温培养箱，75%酒精，棉签，香柏油， 二甲苯等。【实验方法】1、用微量加样器，吸取
2、肝素20ul加入洁净凹 玻片凹孔内。2、用酒精棉签消毒手指后，刺破皮肤，以血 红蛋白吸管取血40ul，立即放入盛有肝素的凹玻片凹孔 内，并充分混匀。3、用微量加样器取葡萄球菌菌液20ul加入上 述凹玻片凹孔内，充分混匀。4、将凹玻片置于湿盒内，30温箱中30min ，其间每隔10min摇匀一次。5、取一小滴上述混合液，置于载玻片上，用 另一载玻片推成薄血片，待干。6、滴加甲醇固定3min，水洗。7、加碱性美蓝染色12min，水洗，印干。8、置油镜下观察吞噬和未吞噬的白细胞并计 数。【实验结果】【实验思考】1、在吞噬细胞中发现细菌 时，如何区别吞噬的细菌和粘附在 吞噬细胞表面的细菌？2、简述机体
3、非特异性免疫 的概念及特点。凝集反应【实验目的】1了解凝集反应的原理、基本类型 及其临床意义。2掌握玻片凝集实验、间接凝集实 验的实验方法和结果分析。【概述】 在一定浓度的电解质溶液中，颗粒 性抗原与相应抗体结合后，出现肉眼可见的 凝集块，称为凝集反应。凝集反应是一种定 性的检测方法，也可以进行半定量检测。凝 集反应可分为直接凝集反应和间接凝集反应 。由于凝集反应方法简便，目前在临床检验 中仍被广泛应用。 一、直接凝集反应细菌、细胞等颗粒性抗原，在适当电解质 参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为直接 凝集反应 。常用的凝集试验有玻片法和试管法两 种。 玻片凝集试验ABO血型鉴定玻片凝集试验
4、为定性试验，一般用已知抗 体作为诊断血清，与受检颗粒抗原，如菌液或红细 胞抗原各加一滴在玻片上，混匀，数分钟后即可用 肉眼观察凝集结果，出现凝集颗粒的为阳性。此法 简便，快速，适用于从病人标本中分离得到的菌种 的诊断或分型，也可用于红细胞ABO血型的鉴定。【实验原理】人类ABO血型抗原主要有A和B两种， 根据红细胞表面这两种抗原的有无可把血型 分为四种。据此，将抗A和抗B抗体分别与待 测红细胞混合，抗A或（和）抗B抗体与红细 胞表面上的相应抗原结合而引起红细胞凝集 ，据其凝集情况便可判定出受试者的血型。ABO血型的划分 红细胞表面Ag血清中AbA型A抗BB型B抗AAB型A、B、O型、抗A、抗B
5、【实验材料】1ABO血型鉴定试剂盒 内含 抗A分型试剂和抗B分型试剂各1支。2一次性采血针1枚、洁净玻 片2块、75酒精、灭菌棉签。384消毒液3用酒精棉签消毒被检者手指尖端 ，以采血针刺破皮肤，稍加挤压，使血液流 出。用另一载玻片一端取适量血液加入抗抗A 分型试剂，并混匀；用另一端再取适量血液 加入抗抗B分型试剂，并混匀。用干棉签止血 。 4观察红细胞有无凝集发生。如有 凝集，可见红细胞凝集成块；无凝集，红细 胞呈均匀分散。判定结果后把玻片放入消毒 液中。AB【实验方法】1取洁净载玻片1块，并标记（如图 ）2将抗A、B分型试剂分别加 1滴于标记有A、B的玻片两侧。抗 A抗 B抗A分型试剂侧抗
6、B分型试剂侧血型+A+B+ABO“”表示红细 胞凝集，“”表示红细 胞未凝集【实验结果】记录受检者红细胞凝集情况，根 据ABO血型鉴定表(下表)，判断受检 者的血型。ABO血型鉴定表二、间接凝集反应将可溶性抗原或抗体先吸附于适当 大小的颗粒性载体表面（这种载体与免疫无关 ），然后与相应抗体或抗原结合，在适量的电 解质存在下，出现特异性凝集现象，称为间接 凝集反应。根据载体的不同可将间接凝集反应 分为：间接血细胞凝集试验、间接乳胶凝集试 验（及间接乳胶凝集抑制试验）和金黄色葡萄 球菌协同凝集试验等。间接凝集抑制试验妊娠试验 【实验原理】可溶性抗原致敏的乳胶颗粒与相应抗体作 用可使乳胶颗粒凝集，此
7、为间接乳胶凝集试验。若 使抗体先与可溶性抗原作用，再加入该抗原致敏的 乳胶颗粒，则乳胶凝集被抑制，此为间接乳胶凝集 抑制试验。孕妇尿中绒毛膜促性腺激素（HCG）含量 明显增高。HCG与抗HCG抗体先作用后，再加入HCG致 敏的乳胶颗粒，不出现凝集反应，此为妊娠试验阳 性；非孕妇尿中HCG含量不足以消耗掉抗HCG抗体， 抗体与后加入的HCG致敏乳胶结合呈现凝集现象，则 妊娠试验阴性。【实验材料】1妊娠诊断试剂盒：内含抗 血清（抗HCG）、乳胶抗原（HCG致敏 ）各一支2待检尿、孕妇尿、正常尿 。3有格玻片和毛细吸管等。【实验方法】1在玻片的第1、第2和第3格内分 别加1滴正常尿、待检尿及孕妇尿。
8、2每格内加入妊娠诊断试剂抗血 清1滴。轻轻摇动12 min使其充分混匀。 3每格加入乳胶抗原1滴，轻轻摇 动玻片35 min后观察结果，记录各标本有 无凝集现象。 【实验结果】孕妇尿格呈均匀浑浊乳状液，无凝 集，妊娠试验阳性；正常尿格出现白色细小 凝集物，随时间延长凝集物变成小块状，妊 娠试验阴性。待检尿若为乳状液，妊娠试验 阳性；若出现凝集，则妊娠试验阴性。【注意事项】1试验所用诊断试剂用前应充 分摇匀，而且应在有效期内使用。2加样用的滴管及混匀用的牙 签不能共用。3加样不宜太多，玻片应始终 保持水平，以防两格之反应液相混。【实验思考】 1记录血型鉴定试验、乳胶妊娠 诊断试验的材料、方法及结
9、果判定（可用 图示或表格方式表示）。2直接凝集试验与间接凝集试验 有何不同？3在各凝集试验中都设有相应对 照，有何意义？若对照出现异常如何分析 及解决？沉 淀 反 应 【实验目的】 1掌握对流免疫电泳的基本原理 、方法。 2熟悉琼脂单向扩散，双向扩散 的基本原理、方法、结果分析及临床用途 。3了解火箭免疫电泳的基本原理 、方法。【概述】可溶性抗原如血清、毒素、细菌 浸出液等与相应抗体结合，当两者比 例合适、并有适量电解质存在时，形 成肉眼可见的沉淀物或沉淀线，称为 沉淀反应。沉淀反应是临床上最常用、最基 本的方法之一。它的种类较多，可分 为琼脂扩散试验、免疫电泳试验、环 状沉淀试验及絮状沉淀试
10、验等。 一、琼脂扩散试验利用可溶性抗原与相应抗体在半固 体琼脂内进行扩散，当两者比例合适时， 就出现白色沉淀线，为阳性反应。本试验 可在试管内、平皿中以及玻片上的琼脂内 进行操作。琼脂扩散试验可分为单向琼脂扩 散试验和双向琼脂扩散试验。(一)单向琼脂扩散试验 (示教)(二)双向琼脂扩散实验 (示教)二、对流免疫电泳 【实验原理】带电的胶体颗粒可在电场中移动， 移动方向与胶体颗粒所带电荷有关。多数蛋 白质抗原在碱性缓冲液中带负电荷，在电泳 时从负极向正极移动。抗体属球蛋白，在碱 性缓冲液只带微弱的负电荷，而且相对分子 质量较大，电泳力较小，在琼脂电渗力作用 下反而由正极向负极移动。这样就使抗原和
11、 抗体定向对流，在两孔间相遇时发生反应， 并在比例合适处形成肉眼可见的白色沉淀线 。这种将双向琼脂扩散和电泳技术结合在一 起的方法称为对流免疫电泳 。【实验材料】1电泳缓冲液：pH 8.6巴比妥-盐 酸缓冲液。2抗体：抗AFP。3抗原：AFP阳性血清、待检病人 血清。41琼脂 用pH 8.6巴比妥-盐酸 缓冲液配制，冰箱保存备用。5电泳仪、电泳槽、载玻片、打 孔器、10 ml吸管、移液器、移液头。 【实验方法】1制板2打孔3加样 将抗原加入琼脂板上有标记 孔侧的小孔中，抗体加入另一侧小孔中，以加 满为度，不可溢出孔外。(如图示)4电泳 将加好样品的琼脂板置电泳 槽上，抗原侧置阴极端，抗体孔侧置
12、阳极端。 搭好桥后，接通电源，控制电压610 V/cm板 长，电泳约3060 min。5关闭电源，取出琼脂板，观察结 果。 AgAbAgAb标记孔 沉淀线【实验结果】将玻片对着强光源，先观察AFP 阳性血清孔与抗体孔之间的白色沉淀线 ，然后再观察待检血清孔与抗体孔之间 是否也有沉淀线出现，如有沉淀线，则 表示AFP试验阳性，否则AFP试验为阴性 。【注意事项】1电泳时电流不宜过大，以免 蛋白变性。2抗原和抗体的电极方向不能 搞错。3抗原和抗体的浓度要适当， 抗原太浓或太稀都不易出现沉淀线。4电泳所需时间与孔间距离有 关，距离越大，电泳时间越长。 【实验思考】1单向扩散与火箭电泳、 双向扩散与对
13、流免疫电流比较各有 何特点？2对流免疫电泳中，抗原 为何放阴极端，抗体为何放阳极端 ？ 外周血单个核细胞的分离 【实验目的】1熟悉免疫细胞分离的 常用方法。2掌握外周血单个核细 胞分离方法的原理、操作规程。 【实验原理】人外周血单个核细胞（ peripheral blood mononuclear cell， PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞。单个核 细胞的体积、形态和比重与外周血其他细 胞不同。因此利用一种介于1.0751.090 之间而近于等渗的聚蔗糖-泛影葡胺（ ficoll-hypaque）混合分离液作密度梯度 离心，离心后不同比重的血细胞在分离液 中呈梯度分布。从而分离出PBMC。【
14、实验材料】 1肝素溶液 用生理盐水将肝素配成125 250 U/ml的溶液，置4 下保存备用。 2淋巴细胞分层液 市售或自配，20 时 密度应为(1.0770.001) g/L。 3Hanks平衡盐溶液（HBSS）或磷酸盐缓冲 液（PBS）pH 7.27.4。 4完全RPMI-1640培养液。 515 ml或50 ml锥底离心管。 6水平离心机，显微镜。 7玻璃吸管，滴管，细胞计数板等。 82台盼蓝染液。【实验方法】 1采集静脉血若干毫升（随需要而定 ），注入盛有肝素的无菌小瓶中（每ml全血加 0.1 ml 肝素溶液），加盖后立即轻轻摇匀，使 血液抗凝。2用吸管加入等体积的室温HBSS或PBS
15、 ，使血液等倍稀释。（此步骤亦可省去）3吸取淋巴细胞分层液（每10 ml稀释 血加5 m1分层液）置于15 m1或50 m1离心管中 ，然后将离心管倾斜45角，将稀释血液在距 分层液界面上1 cm处沿试管壁缓慢加至分层液 上面。应注意保持两界面清晰，勿使血液混入 分层液内。 4将离心管置水平式离心机内，在18 20 下，以2000 r/min离心30 min，离心后 ，管内分层如下图所示5用毛细吸管轻轻插入灰白色层， 沿管壁轻轻吸出该层的单个核细胞，盛入另 一支离心管中。6将所得到的PBMC悬液用5倍体积的 HBSS或RPMI-l640洗涤2次，依次以2 000 r/min，1500 r/mi
16、n在室温（1825）下离 心10 min，弃上清。7用完全RPMI-1640定容细胞，计数 细胞后再调整细胞至所需浓度。8用台盼蓝染液检查所分离细胞的 活性：取2滴细胞悬液加1滴2台盼蓝染液， 510 min后取样作湿片高倍镜检。 【实验结果】台盼蓝染液检查活细胞不着色，死 细胞染成蓝色。计数200个细胞，计算活细胞 百分率，一般活性应在95以上。 【注意事项】1与血液样品接触时应注意安全防护，避 免血源性传染病传染。2操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀，避 免损伤细胞活性及细胞丢失。3细胞分层液在室温下应为 (l.0770.001) g/L；应避光4 下保存，取出后 逐渐升至室温后混匀，方可使用。使用中应避免细 菌污染。4稀释血液可降低红细胞的凝集，提高淋 巴细胞收获量，但如果要保留血浆成分作其他实验 用时，则不能稀释血液，以免影响血浆成分。 免疫系统组分的分离及活
